METHODICAL APPROACHES TO EXPERIMENTAL STUDY OF HISTOPHYSIOLOGY OF MUCOCILIARY TRANSPORT SYSTEM IN THE UTERINE TUBES

Full Text

Эффективная работа мукоцилиарной транспортной системы (МЦТС) маточных труб (МТ), наряду с перистальтическими сокращениями гладкомышечных элементов, является важнейшим механизмом, обеспечивающим транспортную функцию органа [6, 8]. С целью ее изучения в экспериментальных условиях (мыши, морские свинки, крысы, коровы) в литературе описаны различные методические подходы к изучению параметров мукоцилиарного транспорта в органе. Скорость движения слизи (СДС) рассчитывается на основе покадрового анализа файлов, полученных при видеомикроскопии фрагментов МТ в опытах ex vivo; в качестве инертных маркеров регистрации движения слизи используются полиэстеровые микросферы диаметром 2,8 мкм [7, 9] или мелкие частицы (фрагменты клеток, эритроциты), образовавшиеся при подготовке образца [11]. Частота биения ресничек (ЧБР) рассчитывается при анализе цифровых файлов, полученных методом скоростной микровидеосъемки фрагментов МТ, путем оценки числа фреймов, захватывающих полный цикл биения ресничек и продолжительности одного фрейма или с помощью компьютерного спектрального анализа на основе одномерного временного преобразования Фурье [1, 5, 9, 10]. При этом технические особенности подготовки материала для прижизненных исследований, регистрации показателей и их математической обработки в работах разных авторов существенно варьируют, а результаты, полученные с помощью различных методических подходов, могут различаться и не всегда сопоставимы [8, 11]. В связи с этим задача отработки оптимальной последовательности и стандартизации техники исполнения исследовательских манипуляций, позволяющих на основе возможностей современных аппаратных технологий и программного обеспечения в максимально короткие сроки изучить структурные и функциональные параметры МЦТС маточных труб экспериментальных животных, сохраняет высокую актуальность. В рамках ее решения на кафедре гистологии Ярославского государственного медицинского университета отработан и успешно апробирован в практике научных исследований алгоритм функционального и морфологического анализа маточных труб мелких лабораторных животных (белые крысы, мыши и морские свинки), включающий: прижизненное исследование (1-й этап), количественный анализ фиксированных макропрепаратов и цифровых фото-и видеофайлов (2-й этап), гистологическое исследование микропрепаратов (3-й этап). Все эксперименты проведены в соответствии с отечественными нормативами и современными международными биоэтическими стандартами по работе с лабораторными животными (заключение этического комитета ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава РФ, протокол № 4 от 18.10.2016 г.). 1. Прижизненное исследование (на примере крыс линии Вистар). Эксперименты выполняли на взрослых наркотизированных животных (уретановый наркоз, 1000 мг/кг внутрибрюшинно). Крысу помещали на спину, после чего производили послойные разрезы передней стенки брюшной полости в области ее нижней трети, с помощью ранорасширителя обеспечивали доступ к правой и левой МТ. Последние у крыс представляют «клубок» из петель, соединенных прослойками рыхлой соединительной ткани (рис. 1). а) Определение скорости движения слизи на уровне органа in vivo. Применительно к МТ применяли методику, основанную на изучении скорости транспорта в слизи биологически инертного красителя [2]. В правую МТ с помощью микрошприца в область воронки вводили 0,05 мкл 0,5 % раствора витального красителя трипановый синий (Biochem, Франция) на питательной среде «Игла МЕМ» с L-глутамином. Через 50 с МТ извлекают из брюшной полости и с целью остановки движения слизи фиксируют в 96 % этаноле или жидкости Карнуа. Время от введения красителя до погружения в фиксатор составляет 1 мин. б) Изучение двигательной активности цилиарного аппарата и скорости движения слизи в пристеночном слое ex vivo. Использовали усовершенствованную и адаптированную для условий эксперимента методику прямой видеорегистрации двигательной активности цилиарного аппарата в биоптатах мерцательного эпителия с последующим компьютерным спектральным анализом цифровых видеофайлов на основе одномерного временного преобразования Фурье [1, 3]. Данные подходы реализованы в виде специализированного программно-аппаратного комплекса «Азимут-4» (НПО «Азимут», Санкт-Петербург, Россия). В отличие от исходной версии со скоростной аналоговой видеокамерой, описанной нами ранее [5], в существующей модификации он включает: •микроскоп Биомед-2 вар.3 (ЛОМО, Россия) с системой оригинального светодиодного освещения с функцией стробоскопии, управляемой в ручном и автоматическом режиме; •скоростную цифровую видеокамеру Grasshopper 3 2.3 MP Color USB3 Vision (FLIR Integrated Imaging Solutions Inc., Canada), максимальное разрешение 1920×1200 пикселей, частота съемки - 160 Гц; •высокопроизводительный компьютер с процессором CPU Intel Core i7-6700, памятью DDR4 16Gb 2400 MHz, видеокартой GeForce® GTX 1060 6Gb; •специализированную компьютерную программу для обработки видеофайлов MOSFRO (v. 4); •усовершенствованную систему термостатирования НПО «Азимут» (блок управления, термостолик микроскопа, операционный термостолик, термостат для объектива). •Данная оригинальная отечественная разработка позволила существенно повысить качество и контрастность изображения за счет эффекта стробоскопии и обеспечить высокую точность измерений; в рамках использования единой программы обработки изображений обеспечивалась возможность: •на основе автоматического выбора участка измерений и высокой скорости видеозахвата определить не только частоту биения ресничек, но и визуализировать истинную форму их движения в реальном масштабе времени и рассчитать соотношение фаз (замаха и удара); •измерить параметры тока жидкости, создаваемого биением мерцательного эпителия в пристеночном слое, включая скорость движения слизи и частиц в ней, форму движения последних (линейно, нелинейно, поступательно, турбулентно); •сохранять полученные результаты в электронной базе данных и проводить их статистический анализ. Левую МТ извлекали и переносили в чашку Петри с подогретой до 32±0,5 °С средой «Игла МЕМ» с L-глутамином, помещенную на поверхности термостолика. Под контролем бинокулярного стереомикроскопа Микромед MC-2-ZOOM (вар. 2СR) с помошью пинцетов с минимальной травматизацией производили выделение отделов (воронку и ампулу маточной трубы, а также ее маточную часть) и вручную с помощью лезвия безопасной бритвы изготавливали срезы толщиной не более 1 мм. Оставшиеся отделы МТ помещали в фиксирующую среду для последующего гистологического изучения. Биоптат помещали в лункообразное углубление предметного стекла, заполненного средой «Игла МЕМ» при температуре 32 ºС, накрывали тонким покровным стеклом. Под объективом микроскопа 40 и 100 производили поиск зоны с четкой видимостью движущихся ресничек мерцательного эпителия. Изображение воспроизводили на мониторе компьютера в режиме реального времени. После нахождения одной из зон объекта производили захват сфокусированных изображений с последующим сохранением видеофайлов длительностью 15 с. От одного образца при каждом увеличении записывали не менее 3-5 видеофайлов. После завершения животных выводили из эксперимента декапитацией. Общая продолжительность этапа - не более 15-20 мин в расчете на 1 животное. 2. Количественный анализ фиксированных макропрепаратов и цифровых фото-и видеофайлов. а) Определение скорости движения слизи на уровне органа in vivo. После фиксации с помошьюпинцетов стонкимибраншами появляется возможность «размотать» клубочек МТ без повреждений и в виде трубочки поместить орган на линейку со шкалой (цена деления 0,1 мм) под стереомикроскоп Микромед MC-2-ZOOM (вар. 2СR) с последующим захватом изображения и созданием файла в графическом формате (рис. 2). Продвинувшийся за время эксперимента столбик слизи содержит разведенный витальный краситель и приобретает бледно-голубой оттенок, что позволяет на макропрепарате четко определить границы зон введения красителя и неокрашенной слизи. С учетом времени экспозиции между инъекцией красителя и фиксацией органа (60 с) величина СДС1 (мм/мин) рассчитывается как длина участка МТ, содержащего разведенный витальный краситель, измеренная от места инъекции до четкой границы с неокрашенной жидкостью. С помощью прикладной программы системы автоматического проектирования (САПР) Компас-3D V12 на цифровой фотографии определяли длину отрезка линейки, равного 1 мм (см. рис. 2, г), и длину кривой Безье между начальной и конечной точками (см. рис. 2, стрелки), соответствующую пути прохождения краски за 1 мин. б) Измерение двигательной активности, линейных размеров цилиарного аппарата и скорости движения слизи в пристеночном слое. Математическая обработка видеофайлов проводилась при помощи специализированной компьютерной программы MOSFRO (v. 4). Последняя позволяет воспроизводить видеофайл, выполнить покадровый просмотр и провести весь комплекс необходимых измерений. • Подсчет частоты биения ресничек (ЧБР) и измерение линейных размеров проводили на видеофайлах, полученных при использовании объектива 100 (ширина участка захвата - 15 мкм). После запуска видеофайла программа автоматически фиксировала изменение яркости в движущихся ресничках и рассчитывала частоту колебаний объектов (Гц), а также соотношение и симметричность фаз (замаха и удара). • Для измерения линейных размеров объектов на монитор выводится фрейм изучаемого видеофрагмента с наиболее сфокусированными микроструктурами (рис. 3, а). На границы объекта (основание и конец реснички, базальная мембрана и вершина тела клетки) при помощи компьютерной мыши наносили идентификационные точки, после чего программа автоматически рассчитывала величину показателя. Средние значения ЧБР и линейных размеров в расчете на одно животное определяли на основании усреднения результатов не менее 5 измерений на 5-10 видеофайлах. Определение скорости движения слизи в пристеночном слое (СДС2) проводили на видеофайлах, полученных при использовании объектива 40 (ширина участка захвата - 250 мкм). СДС2 определялась путем измерения пройденного расстояния движущихся мелких микроскопических объектов (частицы, пузырьки воздуха) в поверхностном слое над продольно срезанными участками эпителиальной выстилки МТ за единицу времени. На монитор выводили начальный фрейм изучаемого видеофрагмента, на котором выбирали и обозначали микроскопический объект при помощи компьютерной мыши. После запуска видеофайла программа автоматически определяла длину и время пути частицы и рассчитывала ее скорость (см. рис. 3, б). У каждого животного измеряли не менее 5 микрообъектов в пристеночном слое толщиной 25 мкм в продольном потоке. Длина пробега частиц для измерений составляла 25-150 мкм, диаметр частиц - не более 3 мкм. 3. Гистологическое исследование. Особенности методического исполнения данного этапа определяются дизайном конкретного исследования. В формате задач, решаемых в нашей лаборатории, он включал стандартную гистологическую обработку фрагментов МТ (фиксация, заливка в парафин, изготовление срезов толщиной 3-5 мкм), окраску гематоксилином - эозином, проведение ШИК-реакции (рис. 4, а). Для визуализации внутреннего рельефа МТ проводили исследование фиксированных 10 % формалином фрагментов органа методом низковакуумной сканирующей электронной микроскопии на базе лаборатории Центра коллективного пользования Ярославского филиала Физико-технологического института РАН «Диагностика микро-и наноструктур» (см. рис. 4, б, в). Таким образом, предложенная последовательность и техническая реализация этапов изучения морфофункциональной организации эпителиальной выстилки маточных труб позволяет за короткий период времени (до 20 мин в расчете на 1 животное) с минимальной трудоемкостью прижизненно зарегистрировать и задокументировать в цифровой форме изучаемые процессы и провести взятие материала для морфологического анализа органа. Описанные подходы обеспечивают достаточно высокую воспроизводимость результатов (величины коэффициентов вариации изученных функциональных показателей в группах из 7-10 интактных животных не превышают 10-12 %) и позволяют эффективно провести комплексный морфофункциональный анализ исследуемого объекта в условиях эксперимента. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. В. П. Сбор и обработка материала: Т. В. К., Л. И. Е., О. А. Ф. Статистическая обработка данных: Т. В. К., Ю. А. Л. Анализ и интерпретация данных: А. В. П., Т. В. К. Написание текста: А. В. П., Т. В. К., О. А. Ф. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. V. Pavlov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: pavlov@ysmu.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

T. V. Korablyova

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

L. I. Yesev

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

O. A. Fokanova

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

Yu. A. Lukashevich

P. G. Demidov Yaroslavl’ State University

Email: lukashevich.yuriy@gmail.com
Department of Infocommunications and Radiophysics, Faculty of Physics 14 Sovetskaya St., Yaroslavl’ 150003

References

Supplementary files