ULTRASTRUCTURE OF AFFERENT SYNAPSES ON THE VENTRAL DENDRITE OF MAUTHNER NEURONS AFTER GOLDFISH ADAPTATION TO OPTOKINETIC STIMULATION

Full Text

Адаптация мальков золотых рыбок к длительной стимуляции вестибулярного или зрительного укрепляется благодаря полимеризации актина в аппарата представляет собой удобную модель цитоплазме МН и в актинсодержащих [4] синапдля изучения нейробиологических феноменов об-тических десмосомоподобных контактах (ДПК). учения и памяти [1, 6, 8–11]. Адаптированное Как было показано, ДПК окаймляют активные состояние рыбки развивается под воздействием зоны (АЗ) и управляют уровнем секреции нейромногодневных тренировочных сеансов стимуля-трансмиттера из пресинаптической терминали в ции вследствие модификации структуры и функ-синапсах аксонов корешков вестибулярного нерва ции маутнеровских нейронов (МН). Эти парные на соме и латеральном дендрите [4, 6, 7, 9]. ретикулоспинальные клетки, ответственные за В то же время, ультраструктурные основы повороты рыбки вправо и влево, управляются адаптации золотых рыбок к зрительной стимудвумя типами корешков, статоакустическим, даю-ляции остаются неизученными, в немалой стещим окончания на латеральном дендрите, и зри-пени из-за того, что не были идентифицированы тельным, волокна которого оканчиваются на вентральных дендритах МН. Недавно морфолотральном дендрите [12]. Морфологические исследования показали, что при адаптации к сенсорным гическое исследование воздействия энуклеации стимуляциям размер МН стабилизируется, т. е. глаза и раздельно оптокинетической стимуляции проверочная стимуляция адаптированных рыбок на ультраструктуру вентрального дендрита МН, и не вызывает структурных изменений, присущих расположенных на нем синапсов показало, что на нейронам интактных животных после утомитель-вентральном дендрите имеются многочисленные ной стимуляции (уменьшение объема дендритов, «зрительные» синапсы, которые распределены сомы и нейронов в целом) [9, 10]. Было предполо-по всей его длине [5]. Кроме того, с помощью жено, что это связано с вовлечением в адаптацию иммунозолотой метки определена серотонинерцитоскелета [1], который, как показали исследо-гическая возбуждающая природа этих синапсов и выявлены их специфические ультраструктурные Швеция) и фотографировали с помощью микроскопа NU-2E признаки, необходимые для идентификации на ультратонких срезах [3]. Также были установлены детали строения аксодендритных синапсов, на которых расположены серотонинергические аксо-аксональные синапсы [3], показавшие, что они схожи с тормозными ГАМК-ергическими синапсами, описанными ранее на соме МН [7]. Полученные сведения дали возможность исследовать морфометрические показатели строения АЗ и ДПК в указанных синапсах в норме и после адаптации золотых рыбок к длительной оптокинетической стимуляции с целью определения морфологических механизмов адаптивных изменений синапсов аксонов корешков зрительного нерва на МН. Материал и методы. Работа проведена на 6-месячных золотых рыбках Carassius auratus породы Оранда, около 3 см длиной. У рыбок с помощью теста поведения в узком канале оценивали активность доминантного МН относительно субдоминантного по величине коэффициента моторной асимметрии (табл. 1), а также интегральную активность обоих МН по двигательной активности [1, 2, 6]. Для ультраструктурных морфометрических исследований отбирали только рыбок-левшей, одну интактную (неадаптированную) для контроля и одну из группы адаптированных к контралатеральной оптокинетической стимуляции [1, 10]. Данная стимуляция основана на инстинктивном следовании рыбок за зрительными ориентирами (поперечными полосками), двигающимися в направлении, противоположном предпочитаемой стороне поворотов [11]. Адаптацию к зрительной стимуляции вырабатывали 15-дневной тренировочной стимуляцией, постепенно увеличивая длительность сеансов до 100% от той, которая в норме вызывает инверсию моторной асимметрии (усиленный режим адаптации [1, 10]). Проверочной стимуляции рыбку не подвергали. Мозг адаптированной рыбки фиксировали под холодовой анестезией на 8-е сутки после окончания адаптации. Продолговатый мозг, содержащий МН, фиксировали согласно принятому в лаборатории протоколу [2, 6]. Объемы МН и их частей определяли на основании трехмерной компьютерной реконструкции по гистологическим срезам толщиной 3 мкм [2]. Срезы изготовляли на пирамитоме (LKB, (Carl Zeiss, ГДР) используя цифровую камеру Nikon D5100 (Seiko, Япония). Изучали ультраструктуру вентральных дендритов левых (ипсилатеральных) МН, принимающих на себя основную сенсорную нагрузку во время контралатеральной оптокинетической стимуляции рыбок-левшей [11]. Для этого гистологические срезы, содержащие исследуемые дендриты, переклеивали со стекол на отдельные эпоновые блоки, получали ультратонкие срезы толщиной 70–75 нм с помощью микротома EM UC6 (Leica, ФРГ) и исследовали в электронном микроскопе BS-500 (Tesla, Чехословакия). Съемку вели на фотопленку, количественную информацию получали с фотонегативов, а также анализируя их электронные изображения, оцифрованные с помощью сканера Epson V700 (Seiko, Япония). Для морфометрического анализа структуры синапсов по всей длине вентрального дендрита МН при одинаковом увеличении фотографировали синаптические окончания, соответствующие критериям серотонинергических синапсов корешков зрительного нерва (возбуждающие), а также синаптические бутоны, идентифицированные нами как тормозные синапсы (рисунок, а, б) [3, 5]. Расположенные здесь же смешанные синапсы, имеющие в структуре своего прилегания к дендриту, кроме АЗ и ДПК, также протяженные щелевые соединения и тоже имеющие серотонинергическую природу [3], морфометрическому анализу не подвергались. Измерения проводили в «слепом» варианте с негативов на приборе «Микрофот» (Carl Zeiss, ГДР) с общим увеличением 90 000. С помощью курвиметра измеряли протяженность специализированных контактов — АЗ и ДПК. Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью программы Microsoft Excel пакета программ Microsoft Office 2003. Различия оценивали по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Количественные результаты измерения объемов МН и их частей у интактной рыбки-левши и адаптированной левши, сменившей исходное моторное предпочтение на амбидекстрию, равную вероятность правой и левой стороны поворотов, представлены в табл. 1. Видно, что объем вентрального дендрита ипсилатерального МН у подопытной рыбки более чем в 2 раза уступает объему того же дендрита у противоположного нейрона и у МН в контроле. Следует отметить также меньшие размеры аксонных колпачков, представленных, главным образом, синаптическими окончаниями тормозных волокон, а также начальных сегментов аксонов (до взаимного перекреста) у обоих МН адаптированной рыбки по сравнению с контролем. В целом же, суммарные объемы правых и левых нейронов у интактной и адаптированной рыбки практически схожи (см. табл. 1). Результаты электронно-микроскопического исследования показывают, что длительная оптокинетическая стимуляция в течение 15 сут вызывает негативные изменения ультраструктуры дендритов и расположенных в них синапсов, которые не исчезают в последующие дни отдыха, вплоть до конца наблюдения. Синапсы МН контрольной (интактной) и адаптированной рыбок качественно различаются. В интактном состоянии синапсы имеют обычное строение (рисунок, а), включая повышенную плотность расположения цитоскелетных филаментов в дендрите (расстояние между нитями — 25–30 нм) (см. рисунок, б). После выработки адаптации и последующего отдыха в области ипсилатерального вентрального дендрита МН обнаруживаются запустевшие бутоны, под ними появляются протяженные субповерхностные цистерны. Они отгораживают синапсы друг от друга, искажают очертания синаптических контактов, делая их весьма извилистыми и затрудняя идентификацию (см. рисунок, в). В дендритах образуются вакуоли, протяженность канальцев гладкой эндоплазматической сети возрастает (см. рисунок, г), чаще встречаются канальцы, идущие поперек дендрита, филаменты цитоскелета располагаются более плотно — с промежутком между ними — 20–25 нм. Результаты морфометрического анализа состояния АЗ и ДПК серотонинергических синапсов химической природы разной локализации в контроле и после адаптации к зрительной стимуляции по сравнению с таковым на ипсилатеральном вентральном дендрите представлены в табл. 2. Видно, что протяженность АЗ при адаптации становится на 23% меньше, чем в контроле. Одновременно протяженность индивидуальных сечений ДПК, специализированных контактов, которые присущи только возбуждающим серотонинергическим, но не тормозным синапсам, после адаптации на 71% превышала их размеры в синапсах контрольных МН. В табл. 2 представлены результаты измерения протяженности АЗ в тормозных синапсах, идентифицированных по отсутствию ДПК и наличию гребешковых инвагинаций, в сравнении с размерами АЗ возбуждающих серотонинергических синапсов, располагающихся на тормозных бутонах как аксо-аксональные окончания. Видно, что протяженность АЗ у тормозных синапсов на 21% меньше, чем у возбуждающих синапсов. Более того, после адаптации первые уменьшаются на 19%, тогда как протяженность АЗ в возбуждающих синапсах сокращается почти на треть. После адаптации к зрительной стимуляции протяженность АЗ в тормозных синапсах на 10% меньше, чем в возбуждающих синапсах. Суммарная протяженность АЗ (в пересчете на 1 синапс) тормозных синапсов, располагающихся на поверхности вентрального дендрита интактного МН, составляет 828±63 нм (n=60). В то же время, суммарная длина АЗ у возбуждающего синапса уменьшена более чем в 2 раза и составляет 403±27 нм (n=67). Суммарную протяженность АЗ в синапсах МН у адаптированных рыбок определить оказалось невозможным из-за описанных выше качественных изменений. Обсуждение полученных данных. В настоящей работе впервые исследованы ультраструктурные особенности синаптических окончаний аксонов корешков зрительного нерва, приносящих импульсы к МН у золотой рыбки, адаптированной к действию длительной оптокинетической стимуляции. Несмотря на признаки структурного и функционального утомления МН (сглаживание моторной асимметрии рыбки, изменение объемов МН и их частей, запустевание синапсов и т.д.), специфические изменения АЗ в указанных синапсах на вентральном дендрите явно свидетельствуют в пользу адаптированного состояния. Можно полагать, что именно уменьшение протяженности АЗ в возбуждающих синапсах является структурным механизмом адаптации, ранее в деталях описанным для синаптических окончаний волокон статоакустического нерва, расположенных на латеральном дендрите МН [6, 9]. Этот вывод согласуется с представлениями о роли, которую играют АЗ в регуляции эффективности синаптической передачи, интенсивности секреции нейротрансмиттера из пресинаптического окончания [4, 13]. Очевидно, что и на вентральном дендрите при адаптации к зрительной стимуляции уменьшение протяженности АЗ в серотонинергических синапсах происходит за счет увеличения размеров ДПК. Можно предположить, что это вызвано увеличением содержания в них примембранного филаментозного актина [9]. Однако этот вопрос требует дальнейшего специального исследования, поскольку ультраструктурная организация этих синапсов изучена не так досконально, как синапсов на соме и латеральном дендрите, и необходимо экспериментально убедиться в актиновой природе этих контактов на вентральных дендритах, а также подробнее изучить структурную организацию самих синапсов. В частности, требуют выяснения различия в совместном расположении АЗ и ДПК в синапсах на соме и латеральном дендрите, с одной стороны, и в синапсах на вентральном дендрите, где они не всегда располагаются рядом, а часто далеко отстоят друг от друга. Обращают на себя внимание уплотнение расположения структур и гипертрофия гладкой эндоплазматической сети в цитоплазме вентрального дендрита при адаптации. Так как похожая картина наблюдается в МН после длительной оптокинетической стимуляции интактных рыбок [5], можно заключить, что ультраструктура не вполне восстанавливается после утомления, вызванного тренировочными сеансами. С другой стороны — ранее было отмечено, что гипертрофия гладкой эндоплазматической сети — увеличение протяженности составляющих ее канальцев, располагающихся вдоль и поперек дендрита, сопряженная с уплотнением цитоскелета, является признаком адаптации МН к вестибулярным стимуляциям и связана с компенсаторной перестройкой для поддержания баланса ионов Ca2+ в цитоплазме [8]. Поэтому можно предположить, что подобные ультраструктурные изменения в вентральном дендрите при адаптации к зрительной стимуляции являются не только следами предшествующих тренировок, но имеют также и защитное функциональное значение. В связи с уплотнением расположения структур цитоскелета необходимо отметить, что ранее эта особенность считалась нами главным признаком в реципрокном управлении функциональной активностью МН через вентральный дендрит [5]. В данной работе показано, что уплотнение цитоскелета и уменьшение объема вентрального дендрита при адаптации не сопровождались инверсией моторной асимметрии, хотя и наблюдалось повышение активности обоих МН и, как следствие, возрастание подвижности рыбки после адаптации (с 6,5±0,7 до 10,9±0,5 поворотов в 1 мин). Это может означать, что и утомление, и адаптация имеют пресинаптическую природу, т. е. объясняются специфическими структурными изменениями в пресинаптических бутонах. Только при утомлении в пресинаптических серотонинергических (возбуждающих) терминалях изменения структуры больше выражены, чем при адаптации, и связано это, как показывают морфометрические данные, с сильной или ослабленной секрецией нейротрансмиттера из них, обусловленной максимальным или уменьшенным размером АЗ в двух разных ситуациях. Поэтому и поведенческий эффект различается по силе: в случае утомления наблюдается инверсия моторной асимметрии рыбки, а при адаптации — лишь ее сглаживание. Что касается перестройки постсинаптического цитоскелета, отмеченной в настоящей работе, то она как следствие изменения баланса нейротрансмиттерных влияний на уровне дендрита, по-видимому, вторична. На это могут указывать меньшие в сравнении с контролем изменения плотности расположения филаментов цитоскелета при адаптации, чем при утомлении, вызывающем видимое и без применения морфометрических приемов почти двукратное более плотное их расположение [5]. Возможно также, что особая уплотненность структур цитоскелета является характерной чертой стоения вентрального дендрита, не связанного с функцией, а вызвана другими, пока неизвестными причинами. Отмечено также, что при адаптации уменьшается протяженность АЗ не только в возбуждающих, но и в тормозных синапсах. Последние не имеют исполнительного инструмента регуляции своего размера в виде ДПК [6]. Таким механизмом могло бы служить втягивание гребешка в дендрит, вероятно, аналогичное втягиванию шипиков в дендриты при адаптации мозга сусликов и крыс к гипотермии [14]. Эта структурная перестройка позволила бы уменьшить расположенную на гребешке АЗ. Однако данное предположение требует специальных исследований с использованием трехмерной реконструкции синапсов [7, 9]. Также эти структурные данные показывают, что тормозные влияния на вентральный дендрит ослабевают как в результате снижения влияния серотонинергических синапсов на тормозные, так и за счет уменьшения собственных АЗ тормозных синапсов. Это вполне согласуется с недавно сформулированным предположением о роли торможения в сенсорных путях в поддержании баланса возбуждения и торможения при формировании памяти [15].

About the authors

I. B. Mikheyeva

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: mikheirina@yandex.ru

R. Sh. Shtanchayev

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: rshtanch@mail.ru

N. A. Kokanova

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: kokanchik@rambler.ru

G. Z. Mikhailova

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: mihailova_g@rambler.ru

Ye. N. Bezgina

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: bezgina@mail.ru

N. R. Tiras

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ntiras@mail.ru

D. A. Moshkov

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: d_moshkov@mail.ru

References

Supplementary files