CELLULAR COMPOSITION OF DIFFUSE LYMPHOID TISSUE IN THE MUCOUS MEMBRANE OF HUMAN LARYNX UNDER CONDITIONS OF PHYSIOLOGICAL NORM AND IN FATAL HYPOTHERMIA IN THE REPUBLIC OF SAKHA (YAKUTIA)

Full Text

Проблема обеспечения нормальной жизнедеятельности и работоспособности человека особенно актуальна в условиях сурового климата, когда сочетанное влияние экзо-и эндогенных нагрузок приводит к значительному снижению потенциала организма жителей Севера. Динамические наблюдения ряда авторов свидетельствуют о том, что при воздействии холода на тело человека и животных развивается иммунодефицитное состояние — подавление клеточного и гуморального иммунитета [1, 4, 10, 11, 13]. При адаптации человека к условиям Севера влиянию низких температур, в первую очередь, подвергаются органы дыхания, поскольку они имеют наибольшую среди всех тканей организма поверхность контакта с окружающей средой [2, 10]. Располагаясь у поверхности дыхательных путей, лимфоидная ткань выполняет функцию первого специфического барьера на пути проникновения чужеродных антигенов [5, 12, 15, 17]. Поэтому одним из перспективных направлений исследования воздействия холодового фактора на организм человека является исследование лимфоидной ткани гортани, которая одна из первых подвергается прямому воздействию охлажденного воздуха. Целью данной работы явилось комплексное лимфоидных структур гортани при гипотермии в условиях Республики Саха (Якутия). Материал и методы. Материалом для исследования послужили кусочки слизистой оболочки гортани из области преддверия, левого и правого желудочков и подголосовой области. Объектом исследования служила диффузная лимфоидная ткань слизистой оболочки гортани, изъятая у 56 погибших мужчин, не имевших при жизни патологии органов дыхательной системы, следующих возрастных групп: юношеский возраст (17–21 год) — 13; I период зрелого возраста (22–35 лет) — 17; II период зрелого возраста (36–60 лет) — 15; пожилой возраст (61–74 года) — 11, за период с января 2007 года по август 2011 года на территории Республики Саха (Якутия). Взятие материала осуществляли на базе Государственного бюджетного учреждения бюро судебно-медицинской экспертизы Республики Саха (Якутия). Смерть от гипотермии развивалась чаще всего при температуре окружающего воздуха от –34 ºС до –40 ºС, реже при температуре от –31 до –33 ºС. Все погибшие были распределены на 2 группы (табл. 1): 1-я группа — люди, погибшие в летнее время года (июнь— август) от несовместимой с жизнью механической травмы (контрольная группа); 2-я группа — люди, погибшие от общего переохлаждения организма в зимний период года (декабрь—февраль). Материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, заливали парафином «Histomix» (Фарком, Россия). Парафиновые блоки резали на микротоме Leica HL 1210 (Германия), толщина среза составляла 0,3–0,5 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином— морфологическое исследование реактивности эозином. Цитоархитектонику лимфоидных структур изучали с использованием светового микроскопа Leica DMD (Германия) под масляной иммерсией при увеличении в 90 раз, с помощью 25-узловой окулярной морфометрической сетки С. Б. Стефанова [14]. Подсчет клеток (на единице площади среза, равной 0,016 мм2) проводили в покровном эпителии, собственной пластинке слизистой оболочки гортани и подслизистой основе. При анализе гистологических препаратов учитывали малые, средние, большие лимфоциты, незрелые и зрелые плазматические клетки, макрофаги, тучные клетки, эозинофилы, нейтрофилы, фибробласты, клетки в состоянии митоза, деструктивно измененные клетки. Определяли долю каждого вида клеток от общего количества клеток на единице площади среза. Статистическую обработку полученных данных проводили по методу вариационной статистики с определением средней арифметической (x–), ее ошибки (sx–) [1]. Значимость различий с надежностью 95% (P<0,05) оценивали по показателям t-критерия Стьюдента [7]. Все математические расчеты проводили на табличном редакторе ms Excel 2007. Иммунофенотипирование Т-, В-лимфоцитов и макрофагов (CD3+, CD20+, CD68+) выполнено с применением системы визуализации PolyVue Mous/Rabbit HRP Kit (производитель Diagnostic BioSystems, США) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Демаскировку антигена проводили в течение 2 мин в цитратном буфере (рН 6,0). Первичные антитела (СD20+, CD3+, CD68+) инкубировали при температуре 37 ºС в течение 1 ч. Результат реакции выявляли диаминобензидином [3, 8, 9]. Изучение иммуногистохимических препаратов проводили с помощью микроскопа Leica DMD (Германия) под масляной иммерсией при увеличении микроскопа в 90 раз. Фотографирование микропрепаратов проводилось с помощью цифрового микроскопа Leica (Германия). Данная научно-исследовательская работа была одобрена локальным этическим советом по биомедицинской этике при ЯНЦ КМП СО РАМН. Результаты исследования. Иммунные структуры гортани представлены диффузно расположенными в слизистой оболочке иммунокомпетентными клетками и их скоплениями. Диффузная лимфоидная ткань в разные возрастные периоды обнаруживается в слизистой оболочке всех отделов гортани, в толще собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основе, также встречаются отдельные клеточные элементы в эпителиальном покрове. Лимфоидные скопления расположены в области надгортанника, желудочков гортани и передней стенки подголосовой области. Наиболее плотные скопления лимфоидных клеток выявляются возле сосудов микроциркуляторного русла (рис. 1) и выводных протоков желез. При изучении клеточного состава диффузной лимфоидной ткани гортани у представителей контрольной группы разного возраста выявлено, что в слизистой оболочке гортани встречаются большие, средние, малые лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги, а также в небольших количествах — нейтрофилы и деструктивно измененные клетки. Во всех отделах органа иммунокомпетентные клетки расположены преимущественно цепочкой в субэпителиальном слое и неравномерно в толще слизистой оболочки. В подслизистой основе клетки лимфоидного ряда лежат диффузно, как правило, в строме и вокруг желез. Наибольшее скопление клеток лимфоидного ряда вокруг желез выявляется чаще у людей зрелого возраста. Диффузная лимфоидная ткань гортани с возрастом претерпевает значительные структурные изменения. В норме наибольшее количество иммунокомпетентных клеток встречается в юношеском и I периоде зрелого возраста. Так, в слизистой оболочке всех отделов гортани доля малых лимфоцитов от общего количества клеток на срезе значимо больше в юношеском и I периоде зрелого возраста по сравнению с другими возрастными группами (табл. 2). Количество плазматических клеток в диффузной лимфоидной ткани во всех отделах гортани также больше в юношеском возрасте. Доля клеток с картинами митозов в слизистой оболочке преддверия гортани в I периоде зрелого возраста в 2,2 раза больше по сравнению с таковой во II периоде зрелого возраста. В слизистой оболочке желудочков гортани наибольшее содержание клеток с картинами митозов было значимо больше в юношеском и I периоде зрелого возраста (в 1,8 раза), чем во II периоде зрелого возраста. Содержание макрофагов в стенках преддверия гортани выше во II периоде зрелого возраста, тогда как в желудочках гортани и подголосовой области доля этих клеток значимо больше в юношеском периоде по сравнению с другими возрастными группами. В пожилом возрасте во всех отделах гортани выявлены единичные митотически делящиеся клетки или они вовсе отсутствовали. Вместе с тем, во II периоде зрелого и пожилом возрасте значимо увеличивается доля клеток в состоянии деструкции во всех отделах гортани (см. табл. 2). У мужчин, погибших от переохлаждения, многослойный плоский эпителий слизистой оболочки гортани набухает, в эпителиоцитах наблюдается депонирование большого количества слизи, в собственной пластинке — отек, железы и их выводные протоки расширены, в их просвете обнаруживаются скопления слизи (рис. 2). Выявлена высокая изменчивость клеточного состава диффузной лимфоидной ткани гортани в условиях воздействия холодового фактора в разных возрастных группах. Так, в стенке преддверия гортани у людей, погибших от общего переохлаждения, доля клеток лимфоидного ряда несколько больше в юношеском и I периоде зрелого возраста. Содержание плазматических клеток в I периоде зрелого возраста было больше в 1,6 раза, чем во II периоде зрелого возраста, ив 1,8 раза больше, чем в пожилом возрасте. Макрофаги преобладали в юношеском возрасте. Клеток в состоянии деструкции было значимо больше в пожилом возрасте по сравнению с другими возрастными периодами (см. табл. 2). В слизистой оболочке желудочков гортани количество малых лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов значимо больше в юношеском возрасте по сравнению с таковым в других возрастных группах. Вместе с тем, в пожилом возрасте закономерно большее количество составляли клетки в состоянии деструкции. Так, по сравнению с I периодом зрелого возраста их содержание было больше в 1,5 раза. Клетки с картинами митозов встречались только в I периоде зрелого возраста (см. табл. 2). В подголосовом отделе количество малых лимфоцитов в юношеском возрасте в 1,3 раза больше, чем во II периоде зрелого возраста, ив 1,4 раза больше, чем в пожилом возрасте. Доля плазматических клеток была в 2,5 раза больше в I периоде зрелого возраста по сравнению с таковой в пожилом возрасте. Макрофагов и клеток в состоянии деструкции также встречалось значимо больше в пожилом возрасте. Клетки с картинами митозов в этом отделе были обнаружены только в юношеском возрасте. Сравнительный анализ клеточного состава диффузной лимфоидной ткани слизистой оболочки гортани у мужчин, погибших от общего переохлаждения организма, и у людей, погибших в летнее время года, показал, что гипотермия вызывает ее значительные количественные изменения. Так, в слизистой оболочке желудочков гортани количество малых лимфоцитов в юношеском возрасте у группы лиц, погибших от общего переохлаждения организма (2-я группа), по сравнению с контрольной группой значимо меньше (в юношеском и II периоде зрелого возраста — в 3,1 раза; в I периоде зрелого возраста — в 3,5 раза; в пожилом возрасте — в 2,9 раза). Доля плазматических клеток в диффузной лимфоидной ткани также значительно уменьшена во всех возрастных группах, но особенно значительно в пожилом возрасте (в 4,2 раза по сравнению с контролем). В слизистой оболочке подголосовой области содержание малых лимфоцитов у мужчин 2-й группы всех возрастов значимо меньше (в 2,1–2,7 раза) по сравнению с таковым в контрольной группе. Количество плазматических клеток по сравнению с контролем также значимо меньше (в 1,8 раза — в юношеском возрасте, в 1,4 раза — в I периоде зрелого возраста, в 1,7 раза — во II периоде зрелого возраста, в 2,2 раза — в пожилом возрасте). Вместе с тем, при смерти от гипотермии доля деструктивно измененных клеток и макрофагов значительно увеличена. Так, в преддверии гортани в юношеском возрасте количество клеток в состоянии деструкции значимо больше такового в контрольной группе в 3,6 раза, в I периоде зрелого возраста — в 4,1 раза, во II периоде зрелого возраста — в 2,3 раза, в пожилом возрасте — в 2,6 раза. Доля макрофагов во все возрастные периоды в 1,4–1,6 раза больше таковой. Доля плазматических клеток в диффузной лимфоидной ткани также значительно уменьшена во всех возрастных группах, но особенно значительно в пожилом возрасте (в 4,2 раза по сравнению с контролем). В слизистой оболочке подголосовой области количество малых лимфоцитов у мужчин 2-й группы во все изученные периоды онтогенеза по сравнению с контрольной группой значимо меньше (в 2,1–2,4 раза). Количество плазматических клеток по сравнению с контролем также значимо меньше (в 1,8 раза — в юношеском возрасте; в 1,4 раза — в I периоде зрелого возраста, в 1,7 раза — во II периоде зрелого возраста; в 2,2 раза — в пожилом возрасте). Вместе с тем, при смерти от гипотермии доля деструктивно измененных клеток и макрофагов значительно увеличена. Так, в преддверии гортани в юношеском возрасте количество клеток в состоянии деструкции значимо больше, чем в контрольной группе в 3,6 раза, в I периоде зрелого возраста — в 4,1 раза, во II периоде зрелого возраста — в 2,3 раза, в пожилом возрасте — в 2,6 раза по сравнению с контролем. Доля макрофагов во все возрастные периоды в 1,4–1,6 раза больше таковой в контрольной группе. При иммуногистохимическом исследовании слизистой оболочки желудочков гортани у мужчин, погибших от общего переохлаждения организма, во всех возрастных группах по сравнению с контрольной группой выявлено значимое снижение Т-клеточного звена (СD3+) — на 24%, В-клеточного звена (CD20+) — на 17% и увеличение макрофагальногистиоцитарной клеточной популяции (CD68+) — на 11% (рис. 3, 4). Обсуждение полученных данных. При сравнительной характеристике цитоархитектоники диффузной лимфоидной ткани стенок гортани в исследуемых возрастных группах в условиях Якутии выявлено, общего переохлаждения организма (в зимний период) что содержание малых лимфоцитов и плазматических клеток, а также клеток лимфоидного ряда, находящихся в состоянии митоза, больше в юношеском и I периоде зрелого возраста. Во II периоде зрелого и пожилом возрасте усиливается клеточная деструкция, более того, в пожилом возрасте отмечается значительное снижение лимфоцитопоэтических процессов, что выражается в снижении числа митотически делящихся клеток. Наши наблюдения совпадают с материалами A. Holibkova [15]. Диффузная лимфоидная ткань слизистой оболочки гортани у людей, погибших от гипотермии, во всех исследуемых группах испытывает истощение, которое проявляется уменьшением числа клеток лимфоидного ряда. При этом эта картина наиболее выражена у мужчин II периода зрелого и пожилого возраста. Сравнительный анализ состава диффузной лимфоидной ткани слизистой оболочки стенки гортани у погибших в условиях гипотермии во всех возрастных группах подтверждает подавление иммунокомпетентных клеток по сравнению с показателями контрольной группы, что характеризуется уменьшением числа Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, плазматических клеток, а также значимым увеличением числа деструктивно измененных клеток и, как следствие, макрофагов. Кроме того, во II периоде зрелого и пожилом возрасте при воздействии гипотермии по сравнению с контролем отмечается значительное подавление лимфоцитопоэтических процессов, что выражается в отсутствии клеток, находящихся в состоянии митоза. В диффузной лимфоидной ткани гортани в обеих исследуемых группах нами не обнаружены эозинофилы, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии антигенного воздействия. Между тем, A. Kay [16] считает, что эозинофилы присутствуют в лимфоидной ткани, принимая активное участие при антигенных воздействиях. Также можно предположить, что холодовой стресс не является фактором, способствующим развитию аутоиммунных реакций. Результаты настоящего исследования подтверждают данные многих авторов [2, 6, 10, 11], указывающие на подавление клеточного и гуморального иммунитета при воздействии на организм низкой температуры.

About the authors

M. T. Buzinayeva

M. K. Ammosov North-Eastern Federal University

Email: 9246637709@mail.ru

D. K. Garmayeva

M. K. Ammosov North-Eastern Federal University

Email: dari66@mail.ru

References

Supplementary files