ADVANTAGES AND DISADVANTAGES OF ZINK-ETHANOL-FORMALDEHYDE AS A FIXATIVE FOR IMMUNOCYTO CHEMISTRY AND CONFOCAL LASER MICROSCOPY



Cite item

Full Text

Abstract

The paper presents an analysis of authors’ results obtained using fixation of various tissues in zink-ethanol-formaldehyde (ZEF). It was found that fixation in ZEF, in comparison with other methods of fixation, allowed to achieve higher sensitivity of immunocytochemical reaction for a large number of antigens studied and, in many cases, to avoid heat unmasking of antigens. It also provided high resolution of the images obtained using the fluorescent and confocal laser microscopy. However, the studies of antigens with small molecular mass revealed the antigen diffusion from the site of original localization. The data obtained suggest that fixation of a material in ZEF fixative is promising for both immunocytochemical studies, including those using the fluorescent and confocal laser microscopy, and general histological practice.

Full Text

Вопрос адекватной фиксации материала при проведении иммуноцитохимических исследований, выполняемых как с научными, так и с диагностическими целями, приобретает первостепенное значение в связи с необходимостью обеспечения сохранности выявляемых антигенов и сохранения их доступности для применяемых первичных антител. Несмотря на то, что в патогистологических исследованиях наиболее часто применяется фиксация материала водными растворами формалина, во многих случаях она представляется неоптимальной, поскольку при этом часть антигенных детерминант оказывается недоступной для взаимодействия с первичными антителами. В связи с этим были предприняты попытки разработать специальные методы фиксации, при помощи которых удавалось бы лучше сохранить маскируемые (либо разрушаемые) при обычной фиксации антигены [31, 32]. Один из таких фиксаторов — цинк-этанол-формальдегид (ЦЭФ) был разработан в 2006 г. в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН [11] и успешно применяется при исследовании не только органов нервной системы, но и других органов и тканей как человека, так и лабораторных животных. Цель настоящего исследования — анализ результатов проведения иммуногистохимических реакций и гистологических окрасок на материале, фиксированном в ЦЭФ, что необходимо для определения позитивного (либо негативного) влияния этого способа фиксации на сохранность различных тканевых антигенов при использовании как обычной световой микроскопии, так и флюоресцентной, а также конфокальной лазерной микроскопии. Для исследования были использованы различные объекты — головной мозг крысы, фрагменты головного мозга человека, плацента человека, сердце, поджелудочная железа, надпочечник, почка, легкое крысы и человека. Сведения об использованном материале, экспериментальных воздействиях и способах эвтаназии животных содержатся в соответствующих опубликованных ранее материа-периментальных животных» (приказ № 755 от лах (ссылки представлены в таблице). 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для фиксации мате Все исследования, выполненные на лабораторных животных, были проведены с учетом по ранее опубликованной прописи: 1 г хлорида «Правил проведения работ с использованием экс-цинка на 90 мл 96% этанола и 10 мл концентрированного (35–40%) раствора формальдегида [11], а также ЦЭФ, разведенный 96% этанолом 1:1. Для сравнения результатов окраски был использован аналогичный материал, фиксированный в 10% формалине, 96% этаноле и жидкости Буэна. Информация об изученных антигенах и использованных первичных антителах представлена в таблице. В результате анализа многочисленных препаратов, полученных после применения фиксации ЦЭФ, для большинства исследованных антигенов было установлено, что использованный способ фиксации позволяет добиться более высокой чувствительности иммуноцитохимической реакции по сравнению с другими методами фиксации и, прежде всего, после фиксации 10% формалином. Фиксация в ЦЭФ позволила в ряде случаев отказаться от обычно рекомендуемой процедуры теплового демаскирования антигенов, что обеспечило сокращение времени, необходимого для проведения исследования и дало возможность лучше сохранить структуру ткани (в связи с устранением высокотемпературного воздействия). Применение методов флюоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии после ЦЭФ обеспечивает высокое качество получаемых изображений [9, 16, 27]. При этом не происходит существенного повышения фоновой автофлюоресценции (в сравнении со спиртовой и формалиновой фиксацией). После фиксации в ЦЭФ хорошо удается не только окраска по Нисслю [11], но и обычные обзорные окраски (гематоксилином — эозином, трихромный метод Массона и другие способы окраски соединительной ткани). После фиксации в ЦЭФ эритроциты приобретают способность ярче окрашиваться эозином, что сближает данный фиксатор с фиксаторами, содержащими соли ртути. Тем не менее, ЦЭФ, помимо отмеченных достоинств, имеет и отдельные недостатки, которые в большинстве случаев могут быть устранены либо предупреждены. Так, при использовании материала, содержащего значительное количество крови (застойное полнокровие сосудов легкого, кровоизлияние в мозг, полнокровие лакун плаценты), на препаратах в области скоплений эритроцитов иногда обнаруживаются отложения черно-коричневого пигмента, который представляет собой формалиновый пигмент [21]. При использовании такого материала фиксатор можно развести 96% этанолом 1:1. Это позволит снизить концентрацию формальдегида в растворе и, таким образом, уменьшить вероятность формирования формалинового осадка в тканях. Можно прибегнуть и к традиционным способам устранения формалинового осадка в срезах [21]. Другим относительным недостатком предложенного способа фиксации является более значительное уплотнение тканей, чем при обычной формалиновой фиксации и фиксации в жидкости Буэна. Данный недостаток никак не проявляется при изучении головного мозга и ряда паренхиматозных органов, но оказывается существенным при изготовлении срезов плотных тканей (ткани кожи, мышечная ткань). В этом случае при изготовлении срезов рекомендуется использовать ротационный микротом и специальные одноразовые лезвия, предназначенные для изготовления срезов плотных тканей. При проведении иммуноцитохимических исследований в редких случаях фиксация в ЦЭФ не оказывается оптимальной. Нами было обнаружено, что при выявлении инсулина и серотонина, несмотря на высокую чувствительность реакции, наблюдается значительная диффузия антигена из области его первичной локализации. При этом более жесткая формалиновая фиксация позволила получить лучший результат — отсутствие диффузии антигена из структур, где он первично был локализован (В-клеток поджелудочной железы для инсулина и нейронов ядер шва среднего мозга, а также энтерохромаффинных клеток и клеток карциноидной опухоли — для серотонина [12]). Учитывая то, что диффузия антигена характерна для растворимых и низкомолекулярных соединений, к которым относятся как серотонин, так и пептидный гормон — инсулин, можно полагать, что ЦЭФ не будет оптимальным фиксатором и для других антигенов, имеющих малую молекулярную массу (аминокислот, отдельных гормонов и низкомолекулярных пептидов) в связи с их частичной растворимостью и способностью к диффузии при фиксации. Представленный анализ результатов собственных данных, полученных при фиксации материала в ЦЭФ, позволяет заключить, что использованный метод перспективен для применения как в иммуноцитохимических исследованиях, таки в общегистологической практике. Кроме того, данный фиксатор обладает достоинствами, позволяющими его рекомендовать для фиксации объектов, предназначенных для последующего проведения флюоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии.
×

About the authors

D. E. Korzhevskiy

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: DEK2@yandex.ru

Ye. G. Sukhorukova

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: len48@indox.ru

Ye. G. Gilerovich

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

Ye. S. Petrova

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

O. V. Kirik

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: olga_kirik@mail.ru

I. P. Grigoriev

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: ipg-iem@yandex.ru

References

  1. Алексеева О. С., Коржевский Д. Э., Отеллин В. А. и др. Преадаптация гипоксией к азотному наркозу и белки теплового шока в нейронах коры головного мозга при этих состояниях. Докл. РАН, 2009, Т. 425, № 4, с. 553–555.
  2. Григорьев И. П., Василенко М. С., Сухорукова Е. Г. и Коржевский Д. Э. Применение различных антител к тирозингидроксилазе для изучения катехоламинергических систем головного мозга млекопитающих. Морфология, 2010, т. 138, вып. 6, с. 60–63.
  3. Григорьев И. П., Гилерович Е. Г., Петрова Е. С. и др. Катехоламинергические структуры переднего мозга крыс после транзиторной ишемии. Регионарное кровообращение и микроциркуляция, 2012, т. 11, № 2, с. 57–60.
  4. Григорьев И. П., Шкляева М. А., Кирик О. В. и др. Распределение альфа-тубулина в структурах переднего мозга крысы. Морфология, 2013, т. 143, вып. 1, с. 7–10.
  5. Закурина А. Н., Коржевский Д. Э. и Павлова Н. Г. Плацентарная недостаточность — морфофункциональные параллели. Журн. акушерства и женских болезней, 2010, т. 59, № 5, с. 51–55.
  6. Кирик О. В., Власов Т. Д. и Коржевский Д. Э. Маркеры нейральных стволовых клеток нестин и musashi-1 в клетках конечного мозга крысы после транзиторной фокальной ишемии. Морфология, 2012, т. 142, вып. 4, с. 19–24.
  7. Кирик О. В., Ворончихин П. А., Чумасов Е. И. и Коржевский Д. Э. Применение реакции на синаптофизин для выявления нейроэпителиальных телец легкого крысы. В кн.: Бабухинские чтения в Орле, М., Из-во ЗАО «Ретиноиды», 2011, вып. 32, с. 70–71.
  8. Кирик О. В. и Коржевский Д. Э. Виментин в клетках эпендимы и субвентрикулярной пролиферативной зоны конечного мозга крысы. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2012, № 4, с. 210–214.
  9. Кирик О. В., Сухорукова Е. Г. и Коржевский Д. Э. Кальцийсвязывающий белок Iba-1/AIF1 в клетках головного мозга крысы. Морфология, 2010, т. 137, вып. 2, с. 5–8.
  10. Колос Е. А. и Коржевский Д. Э. Изучение нейрогенеза в спинномозговых ганглиях крысы с помощью иммуногистохимических маркеров дифференцировки. В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия и пластичность мозга. М., Издво ФГБУ НЦН РАМН, 2012, с. 293–296.
  11. Коржевский Д. Э., Григорьев И. П. и Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях. Морфология, 2006, т. 129, вып. 1, с. 85–86.
  12. Коржевский Д. Э., Драй Р. В. и Костюкевич С. В. Иммуноцитохимический метод выявления EC (энтерохромаффинных)клеток эпителия слизистой оболочки кишки крысы. Морфология, 2008, т. 133, вып. 1, с. 78–81.
  13. Коржевский Д. Э., Кирик О. В. и Безнин Г. В. Метод селективного выявления пролиферирующих клеток в структурах формирующейся нервной системы, основанный на определении фосфорилированного гистона Н3. Морфология, 2012, т. 142, вып. 6, с. 69–72.
  14. Коржевский Д. Э., Кирик О. В. и Гиляров А. В. Клетки головного мозга крысы, содержащие эзрин (цитовиллин). Морфология, 2011, т. 140, вып. 6, с. 86–88.
  15. Коржевский Д. Э., Кирик О. В., Петрова Е. С. и Сухорукова Е. Г. Изучение пролиферации клеток в структурах развивающейся нервной системы. В кн.: Вопросы морфологии XXI века. СПб., Изд-во ДЕАН, 2012, вып. 3, с. 65–69.
  16. Коржевский Д. Э., Кирик О. В., Сухорукова Е. Г. и др. Изучение пространственной организации астроцитов головного мозга при помощи конфокальной лазерной микроскопии. Морфология, 2009, т. 135, вып. 3, с. 76–79.
  17. Коржевский Д. Э., Кирик О. В., Сухорукова Е. Г. и Власов Т. Д. Структурная организация микроглиоцитов стриатума после транзиторной фокальной ишемии. Морфология, 2012, т. 141, вып. 2, с. 28–32.
  18. Коржевский Д. Э., Ленцман М. В., Кирик О. В. и Отеллин В. А. Виментин-иммунопозитивные клетки конечного мозга крысы после экспериментального ишемического инсульта. Морфология, 2007, т. 132, вып. 5, с. 23–27.
  19. Коржевский Д. Э., Отеллин В. А., Григорьев И. П. и др. Иммуноцитохимическое выявление нейрональной NO-синтетазы в клетках головного мозга крысы. Морфология, 2007, т. 132, вып. 4, с. 77–80.
  20. Коржевский Д. Э., Петрова Е. С., Кирик О. В. и Отеллин В. А. Оценка дифференцировки нейронов в эмбриогенезе крысы с использованием иммуноцитохимического выявления даблкортина. Морфология, 2008, т. 133, вып. 4, с. 7–10.
  21. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., Мир, 1969.
  22. Нагорнев В. А., Чумасов Е. И., Коржевский Д. Э. и др. Современные подходы к изучению нервных аппаратов артерий при атеросклерозе и сахарном диабете. Мед. акад. журн., 2010, т. 10, № 3, с. 19–27.
  23. Петрова Е. С. Виментин и глиальный фибриллярный кислый белок в клетках эктопических нейротрансплантатов неокортекса. Морфология, 2011, т. 139, вып. 2, с. 22–26.
  24. Петрова Е. С. Астроглиогенез в гетеротопических аллотрансплантатах эмбрионального неокортекса крыс. Бюл. экспер. биол., 2011, т. 151, № 4, с. 191–195.
  25. Петрова Е. С., Власов Т. Д., Колос Е. А. и Коржевский Д. Э. ГАМК-ергические нейроны стриатума крыс в норме и при ишемическом повреждении. В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия и пластичность мозга. М., Изд-во ФГБУ НЦН РАМН, 2012, с. 347–349.
  26. Петрова Е. С., Исаева Е. Н. и Коржевский Д. Э. Иммуногистохимическое исследование дифференцировки диссоциированных клеток эмбрионального спинного мозга и неокортекса крыс в условиях аллотрансплантации в поврежденный нерв. В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия и пластичность мозга. М., Изд-во ФГБУ НЦН РАМН, 2012, с. 344–347.
  27. Сухорукова Е. Г., Алексеева О. С., Кирик О. В. и др. Сравнительные аспекты структурной организации астроцитов I слоя коры головного мозга человека и крысы. Журн. эволюц. биохим., 2012, т. 48, № 3, с. 280–286.
  28. Сухорукова Е. Г., Кирик О. В. и Коржевский Д. Э. Применение иммуногистохимического метода для выявления микроглии головного мозга в парафиновых срезах. Бюл. экспер. биол., 2010, т. 149, № 6, с. 709–712.
  29. Чумасов Е. И., Ворончихин П. А. и Коржевский Д. Э. Эфферентная иннервация сосудов и бронхов легкого крысы (иммуногистохимическое исследование). Морфология, 2012, т. 142, вып 4, с. 49–53.
  30. Чумасов Е. И., Петрова Е. С. и Коржевский Д. Э. Иммуноморфологический анализ иннервации хромаффинных клеток параганглиев артерий и сердца млекопитающих. Журн. эволюц. биохим., 2011, т. 47, № 4, с. 325–331.
  31. Beckstead J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J. Histochem. Cytochem., 1995, v. 43, № 3, p. 345.
  32. Benerini-Gatta L., Cadei M., Balzarini P. et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic phatology. Europ. J. histochem., 2012, v. 56, p. 63–70.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2013 Eco-Vector


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.