APPLICATION OF THE IMMUNOHISTOCHEMICAL DETECTION OF PGP 9.5 PROTEIN FOR THE STUDY OF RAT AND HUMAN HEART INNERVATION

全文:

Для изучения иннервации внутренних органов, вплоть до 80-х годов, широко использовали известные классические нейрогистологические методы импрегнации нитратом серебра по Бильшовскому—Грос, Бодиану, а также суправительную окраску метиленовым синим. Кроме того, с 70-х годов прошлого века в нейроморфологии нашли применение гистохимические методы, использовавшиеся для выявления катехоламинов по Фальку—Хилларпу, включая обработку тканей глиоксалевой кислотой с целью выявления вегетативных нервных волокон в сочетании с флюоресцентной микроскопией, а также реакции на моноаминоксидазу Гленнера и ацетилхолинэстеразу Колле—Фриденвальда. Эти методы продолжают использоваться и до настоящего времени при изучении сердечно-сосудистой системы в норме и при патологии, хотя и имеют ряд недостатков. Например, не все нервные проводники и нейроны различной медиаторной принадлежности можно выявить с помощью перечисленных методов. По методу Фалька, используемого для изучения нейронов симпатических ганглиев и хромаффинных клеток параганглиев, из-за сильной флюоресценции катехоламинов и высокой плотности нейронов в макро-и микроганглиях и хромаффинных клеток параганглиев, а также клеток мозгового вещества надпочечников не всегда удается определить строение выявляемых клеток, затруднительно проводить и морфометрический анализ. Учитывая важность проблем изучения механизмов нейротрофики, иннервации и функционирования внутренних органов, все большее предпочтение уделяется, наряду с классическими, более точным, прецизионным методам, которые все чаще находят применение в экспериментальных и диагностических исследованиях. К таким иммуногистохимическим методам следует отнести реакции на нейрофиламенты, периферин, синаптофизин, тирозингидроксилазу и некоторые другие. Предварительные результаты, полученные в лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины, показывают, что эти иммуногистохимические методы обладают высокой чувствительностью и селективностью [3, 8]. Одним из таких маркеров структур периферической нервной системы (ПНС) является белок PGP 9.5, который имеет и другое название — убиквитин-C-терминальная гидролаза L1. Этот белок был выделен из мозга человека более тридцати лет назад [11]. Показано, что он содержится преимущественно в цитоплазме нейронов ЦНС и ПНС, а также в нейроэндокринных клетках, и может быть использован в качестве их маркера [16]. Несмотря на то, что функция PGP 9.5 в нервной системе не ясна, он применяется при исследованиях иннервации различных органов: пищеварительного тракта, сердца, плевры, легких, кожи, простаты как взрослых организмов, так и эмбрионов [9, 10, 12–15]. Целью настоящего исследования явились изучение целесообразности применения PGP 9.5 в качестве маркера нервных аппаратов сердца крысы и человека и разработка оптимального протокола для выявления этого белка на парафиновых срезах. В работе использовали крыс линии Вистар (n=10) и аутопсийный материал, полученный в Бюро судебно-медицинской экспертизы СанктПетербурга (n=8). Аутопсийный материал был фиксирован в 10% растворе формалина, а материал, полученный от животных, — в цинк-этанолформальдегиде [2]. Гистологический анализ проводили на парафиновых срезах толщиной 5–7 и 15–30 мкм. После применения разных режимов был выбран оптимальный по трудозатратам и качеству реакции протокол иммуногистохимической реакции для выявления PGP 9.5: Удалить парафин и регидратировать срезы обычным способом. После 5-минутной промывки в дистиллированной воде предметные стекла со срезами поместить в стакан с 3% перекисью водорода на 5–10 мин для блокировки эндогенной пероксидазы. Смыть перекись водорода дистиллированной водой и поместить стекла в 0,01 M фосфатносолевой буфер (ФСБ) с pH 7,4 на 5–10 мин. Промокнув фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов (должно образоваться сухое поле), обвести срезы гидрофобным фломастером (например DakoPen). Нанести на срезы необходимое для покрытия их количество блокировочного раствора 5% бычьего сывороточного альбумина (фракция V по Кону) на ФСБ и оставить при комнатной температуре на 10 мин. Слить излишек блокировочного раствора (без промывки) и, не промокая препараты, нанести на них необходимое количество первичных кроличьих поликлональных антител к PGP 9.5 (Spring Bioscience, США) (в разведении 1:400). Поместить предметные стекла во «влажную камеру» (для этого можно использовать любые пластиковые коробки с крышками, на дно которых положены мокрая фильтровальная бумага и стеклянные палочки) и поставить в термостат при 40 ºС на 60 мин. Смыть антитела ФСБ и затем препарат поместить в тот же буфер на 5–10 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов, нанести необходимое количество вторичных антител (реагент «PolyHRP Reagrnt» из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection System BioGenex, США или реагент «HRP Conjugate» из набора Reveal Polyvalent HRP DAB Delection System, Spring BioGenex, США) и оставить на 35 мин при комнатной температуре. Смыть антитела ФСБ, и затем препарат поместить в тот же буфер на 5–10 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести необходимое количество рабочего раствора хромогена DAB+ (Dako, Дания). На этом этапе происходит образование окрашенного продукта гистохимической реакции. Процесс необходимо контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифической фоновой окраски. Смыть раствор хромогена, и промыть препараты в 3 порциях дистиллированной воды по 3–5 мин в каждой. Докрасить срезы раствором гематоксилина Джилла в течение 0,5 мин, смыть краситель дистиллированной водой и поместить в подщелоченную или водопроводную воду. Обезводить препараты в 96% и абсолютном этаноле (вместо абсолютного этанола можно использовать абсолютированный 99% изопропанол), просветлить в ксилоле обычным способом и заключить в бальзам, полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды. Паралелльно с постановкой реакций по этому протоколу проводили выявление PGP 9.5 на аналогичных препаратах при помощи вторичных антикроличьих меченных тетраметилродаминизотиоцианатом с докраской ядер клеток красителем Hoechst 33342, которые исследовали в конфокальном микроскопе LSM 510 Meta (Zeiss, Германия). Данный протокол отличается от предлагавшихся ранее вариантов обработки гистологических срезов антителами к белку PGP 9.5 тем, что инкубация в первичных антителах производится при высокой температуре (при 40 ºС). Ранее такой подход не применялся. Это позволяет сократить время обработки материала. Кроме того, данный протокол пригоден для выявления антигена на парафиновых срезах тканей и органов как лабораторных животных, так и человека. Анализ препаратов сердца крысы и человека показал, что PGP 9.5-иммунопозитивных нервных волокон (ИПНВ) выявляются во всех оболочках стенки желудочка сердца. Наиболее иннервирована центральная часть миокарда. В ней выявляются как мелкие пучки, так и густая сеть ИПНВ (рисунок, а, б). Она представлена проводниками толщиной от 1,5 до 2 мкм, которые имеют, как правило, то же направление, что и волокна миокарда. ИПНВ дихотомически делятся, и их истонченные веточки заканчиваются различной формы нервными окончаниями, располагающимися в эндомизии вблизи кардиомиоцитов (см. рисунок, в). Иногда концевые структуры встречаются также по ходу некоторых нервных проводников. Важно отметить, что претерминальные и концевые отделы нервных волокон часто сопровождаются нейролеммоцитами (см. рисунок, б). Среди нервных окончаний встречаются иногда клетки с округлыми ядрами, похожими на ядра глиальных вспомогательных клеток, характерных для рецепторных структур. В некоторых местах удалось выявить также ИПВН, тесно связанные с эндотелием капилляров и вен (см. рисунок, г). Кроме описанного выше сплетения, на границе миокарда и эндокарда нами выявлено второе менее выраженное сплетение. Его ИППВ направляются в эндокард, где они разветвляются, образуя в соединительной ткани широкопетлистое сплетение, некоторые его веточки заканчиваются терминальными структурами вблизи эндотелия. Таким образом, результаты настоящей работы показывают, что использованный иммуногистохимический метод является адекватным и перспективным для решения ряда специальных задач и вопросов углубленного изучения нормального строения нервных аппаратов сердца, уточнения их топографии, а также изменений при патологических состояниях. Структурная организация и характер терминальных ветвлений выявляемых нервных аппаратов свидетельствуют об их принадлежности к афферентному звену.

作者简介

D. Korzevskiy

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

Ye. Sukhorukova

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Ye. Petrova

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

A. Tzukanova

Bureau of Forensic Medicine

Ye. Chumasov

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

参考

补充文件