TOPOGRAPHY AND MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS OF NF200 +-NEURONS OF THE SPINAL CORD GRAY MATTER AFTER DEAFFERENTATION WITH CAPSAICIN

Full Text

Для изучения строения и функции органов и тканей в условиях нарушенной афферентации используются иссечение чувствительных узлов спинномозговых и черепных нервов, невротомия, создаются модели гипокинезии и гиподинамии. Внедрение в экспериментальную морфологию методов химической деафферентации позволило уделить особое внимание исследованию состояния нервных структур в условиях дефицита чувствительности. Известно, что введение капсаицина в нейротоксических дозах приводит к гибели капсаицин-чувствительных нейронов, содержащих TRPV1-рецепторы [4, 5, 7], и вызывает изменения состава нейрофиламентов (НФ) в нейронах чувствительных узлов [6, 9, 12]. НФ являются основным структурным компонентом цитоскелета аксонов нейронов. В состав НФ входят 3 нейрон-специфичных белка, различающихся по молекулярной массе: легкий (68 килодальтон), средний (160 килодальтон), тяжелый (200 килодальтон). Последние исследования показали, что особый интерес представляет белок НФ с массой 200 килодальтон, степень фосфорилирования которого определяет взаимодействие между тремя белками НФ [3, 9, 11]. Считается, что нарушение структуры данного типа НФ может изменять состояние всего комплекса цитоскелета аксонов и тем самым влиять на функционирование как аксона, так и нейрона в целом. Однако связь гибели ноцицептивных нейронов, содержащих ваниллоидные рецепторы TRPV1 [1, 2], с развитием нейронов спинного мозга, содержащих иммунореактивный белок НФ, до настоящего времени изучена недостаточно. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение влияния капсаицина на нейроны серого вещества спинного мозга, содержащие белок НФ с массой 200 килодальтон в постнатальном развитии крысы. Материал и методы. Исследование проведено с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) на 80 белых крысах-самках линии Вистар в возрасте 3, 10, 20, 30, 60, 90, 180 и 360 сут. Животные были разделены на 2 группы — контрольную (n=40) (интактные животные) и подопытную (n=40) — экспериментальное моделирование деафферентации. Крысам подопытной группы на 2-е сутки жизни однократно подкожно вводили капсаицин (N-vanillylonanamide, Sigma, США) в дозе 150 мг/кг в растворе, состоящем из 1 части 96% этилового спирта, 1 части Твин-80, 8 частей 0,9% раствора NaCl. Морфометрические и топографические особенности распределения нейронов, содержащих белок НФ 200 килодальтон (НФ200+), изучали в сером веществе II грудного сегмента спинного мозга. Эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии изотоническим раствором хлорида натрия с гепарином (5 ЕД/л), затем 4% раствором параформальдегда на 0,1 М фосфатно-солевом (PBS) буфере. Выделенные сегменты фиксировали в течение 2 ч при 4 ºС в указанной выше смеси, после чего промывали 3-кратно в изотоническом растворе хлорида натрия на PBS в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы на 24 ч. Из фиксированного материала на криостате готовили серии срезов толщиной 20 мкм. Для выявления НФ200+-нейронов применяли мечение мышиными антителами (Abcam, США, разведение 1:300). Срезы преинкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% нормальной ослиной сыворотки, 1% тритона X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% тимерозола. Затем срезы инкубировали с первичными антителами в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромом индокарбоцианином (CY3, Jackson, США, разведение 1:100) в течение 2 ч, дающим красную флюоресценцию. Для расчета доли иммунореактивных нейронов производили мечение всей нейронной популяции красителем, дающим зеленую флюоресценцию при окраске по Нисслю (NeuroTrace Green Fluorescent Nissl Stain, Molecular Probes, США). После промывки в PBS срезы инкубировали в этом растворе в течение 20 мин (разведение 1:200). Анализ препаратов проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Микмед 2, вариант 12 (ЛОМО, Россия) с соответствующим набором светофильтров и CCD-камеры MDC320 (ScopeTec, Китай). На цифровых изображениях гистологических препаратов при увеличении 200, используя программу Image J (NIH, США), оценивали площадь сечения нейронов и производили их подсчет на поперечном срезе сегмента спинного мозга. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро. Для определения топографии нейронов спинного мозга устанавливали соответствие их положения пластинам Рекседа с поправкой для крысы [8, 10]. Статистический анализ включал определение среднего арифметического значения и его стандартной ошибки. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. У контрольных крыс всех возрастных групп на поперечном срезе спинного мозга НФ200+-нейроны были выявлены в вентральном роге, промежуточной зоне, в дорсальном роге. В вентральном роге иммунопозитивные нейроны располагались в виде групп в медиальной и латеральной области до промежуточной зоны, что соответствовало локализации мотонейронов в пластине IX (рисунок, а, б). Количество мотонейронов, выявленных красителем по Нисслю, совпадало с числом НФ200+-нейронов. Цитоплазма тел и аксоны НФ-содержащих мотонейронов имели яркую красную флюоресценцию, интенсивность которой с возрастом крысы не менялась. На поперечных срезах сегмента спинного мозга было видно, что аксоны нейронов направлены вентрально с ориентацией к верхушке рога (см. рисунок, а). Подсчет нейронов, содержащих НФ, показал, что их количество в медиальной и латеральной области в 3-суточном возрасте было одинаковым (табл. 1). В 10-суточном возрасте число иммунореактивных мотонейронов уменьшилось: медиально расположенных — в 4,7 раза, латерально — в 2,5 раза (см. табл. 1). В 20-суточном возрасте количество НФ200+-мотонейронов, расположенных в медиальной и латеральной областях, увеличилось по сравнению с таковым в предыдущей возрастной группе и фактически сравнялось (см. табл. 1). После введения капсаицина НФ200+-мотонейроны выявлялись у животных всех исследованных возрастных групп, топография иммунореактивных клеток на срезе вентрального рога спинного мозга не менялась и соответствовала двум областям: медиальной и латеральной, находящимся в пределах пластины IX. В 3-суточном возрасте количество НФ200+-мотонейронов в латеральной и медиальной областях было одинаковым. В 10-суточном возрасте число НФ200+-мотонейронов уменьшилось: в медиальной области — в 1,7 раза, в латеральной — в 2,0 раза. Минимальное количество выявляемых иммунореактивных мотонейронов наблюдалось в 30–90-суточном возрасте (см. табл. 1). Для подопытной группы существенным являлось значимое снижение числа медиально и латерально расположенных НФ200+-мотонейронов во всех возрастных группах по сравнению с контролем. Так, после введения капсаицина у крыс уже в 3-суточном возрасте количество иммунореактивных мотонейронов было меньше, чем в контроле: в медиальной области — на 19%, латеральной — на 17%. С возрастом происходило снижение числа нейронов в опыте по сравнению с контролем и составляло 70% и более в 20-, 30-, 60-и 90-суточном возрасте. В 180-и 360-суточном возрасте количество НФ200+-мотонейронов в опыте было меньше, чем у контрольных животных в медиальной области на 51,4 и на 48,5% — в латеральных на 42 и 46,4% соответственно. В контрольной группе крыс средняя площадь сечения НФ200+-мотонейронов в течение 1-го года жизни увеличилась: в медиальной области — в 2,0 раза, в латеральной — в 2,7 раза (см. табл. 1). При этом отмечено значимое прогрессивное возрастание средней площади сечения НФ200+-мотонейронов к 10-суточному возрасту, после чего показатели практически не менялись до 360-суточного возраста крысы. У подопытных животных средняя площадь сечения НФ200+-мотонейронов в 3-суточном возрасте превышала контрольные значения только в латеральной группе мотонейронов — на 46%. После введения капсаицина возрастные изменения средней площади сечения иммунопозитивных мотонейронов медиальной и латеральной групп имели иную динамику, с 3-суточного возраста значения этого показателя прогрессивно увеличивались, достигая максимума в 20-суточном возрасте, после чего практически не менялись до конца наблюдения. Анализ средней площади сечения мотонейронов в подопытной группе показал, что медиально расположенные НФ200+-мотонейроны в 10-, 30-, 60-, 90-и 180-суточные возрастные сроки наблюдения имели значимо меньшую среднюю площадь сечения по сравнению с контролем, латеральные НФ200+-мотонейроны — в 3-и 20-суточном возрасте — большую среднюю площадь сечения, чем в контроле, ав 90-и 180-суточном возрасте — меньшую площадь. Таким образом, проведенная химическая деафферентация вызвала изменения в развитии популяции медиальной и латеральной групп НФ200+-мотонейронов, что проявилось уменьшением числа последних и замедленным ростом их площади сечения. Выявляемые НФ200+-нейроны в промежуточной зоне (пластина VII) и в дорсальном роге (пластина III–IV) давали яркую красную флюоресценцию с характерной окрашиваемостью отростков (см. рисунок, в, г). В контроле и опыте в пластинах VII и III–IV, где определялось большое количество нейронов флюоресцентным красителем по Нисслю, выявлялись лишь единичные НФ200+-нейроны — 1–2 клетки на поперечном срезе. Возрастных изменений количества иммунореактивных нейронов в указанных пластинах не выявлено, влияния капсаицина на изменения клеточного состава также не наблюдалось. Анализ средней площади сечения НФ200+нейронов показал, что в контрольной группе клетки имели одинаковые размеры (табл. 2). Так, в пластине VII средняя площадь сечения нейронов за весь период наблюдения увеличилась на 4%, в пластинах III–IV — на 13%. Большее увеличение размеров иммунореактивных нейронов в дорсальном роге связано с меньшими их размерами в 3-суточном возрасте по сравнению с таковым в промежуточной зоне. В целом, возрастная динамика средней площади сечения НФ200+-нейронов в указанных пластинах проявилась в увеличении показателя к 90-суточному возрасту с последующим незначительным снижением — к 360-суточному. В подопытной группе животных средняя площадь сечения НФ200+-нейронов в 3-суточном возрасте превышала контрольные значения на 6% в пластине VII и на 6,5% — в пластинах III–IV. Возрастные изменения средней площади сечения иммунореактивных нейронов после введения капсаицина имели сходную динамику во всех пластинах, но отличались от таковых в контрольной группе: с 3-суточного возраста этот показатель прогрессивно увеличивался до 30-суточного возраста, после чего оставался высоким до 180-суточного возраста и уменьшался в 360-суточном возрасте. Характерным было и то, что в опыте средняя площадь сечения НФ200+нейронов превышала контрольные значения во все сроки наблюдения (см. табл. 2). Таким образом, изменения НФ200+-нейронов промежуточной зоны и дорсального рога при моделировании деафферентации отличались от изменений НФ200+-нейронов вентрального рога: при стабильном количестве площадь их сечения увеличивалась. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования установлено, что НФ200+-нейроны выявляются в вентральном роге, промежуточной зоне, дорсальном роге серого вещества спинного мозга и отличаются по морфометрическим характеристикам и реакции на деафферентацию. В вентральном роге НФ200+-клетки представлены медиально и латерально расположенными мотонейронами (пластина IX). Проведенное иммуногистохимическое двойное маркирование популяции мотонейронов позволяет сделать заключение, что все мотонейроны НФ200+ иммунореактивны. В промежуточной зоне (пластина VII) и дорсальном роге (пластины III–IV) выявлялись единичные НФ200+-нейроны, которые отличались от иммунонегативных отчетливо выраженной флюоресценцией, а от мотонейронов вентрального рога — размерами. Двойное маркирование нейронов серого вещества спинного мозга убедительно свидетельствует о том, что только единичные интернейроны промежуточной зоны и дорсального рога содержат НФ200. Ранее было установлено, что введение капсаицина при использованной модели деафферентации в чувствительных узлах спинномозговых нервов вызывает потерю нейронов, содержащих ваниллоидные рецепторы TRPV1 [1, 2]. Это дает основание связать выявленные изменения НФ200+нейронов серого вещества спинного мозга с констатированной деафферентацией. Дефицит афферентации приводит практически к одинаковому уменьшению количества и средней площади сечения медиально и латерально расположенных НФ200+-мотонейронов. В промежуточной зоне и дорсальном роге изменения количества НФ200+интернейронов в условиях дефицита афферентации не наблюдается, но их средняя площадь сечения превышает показатели в норме. Таким образом, уменьшение числа нейронов в чувствительных узлах спинномозговых нервов приводит к неоднозначной реакции НФ200+нейронов спинного мозга: в вентральном роге уменьшается количество медиально и латерально расположенных мотонейронов и замедляется их рост; размеры интернейронов промежуточной зоны и дорсального рога увеличиваются до 6-месячного возраста, что совпадает с периодом отчетливо выраженных преобразований мотонейронов и может свидетельствовать об их морфофункциональной общности именно с мотонейронами.

About the authors

V. V. Porseva

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: vvporseva@mail.ru

References

Supplementary files