MECHANISM OF HEPATOCYTE APOPTOSIS IN EXPERIMENTAL TOXIC LIVER INJURY

Full Text

В настоящее время показано, что морфологической основой для развития заболеваний многих органов, в том числе печени, служит апоптоз [4, 14]. Запрограммированная клеточная гибель (апоптоз) гепатоцитов играет важную роль в патогенезе гепатитов, в том числе вирусных [4], канцерогенезе [8, 10] алкогольного [9] или лекарственного повреждения печени [12, 15]. Лечение тяжелых хронических заболеваний, к которым относится и туберкулез, связано с длительными курсами сильнодействующих препаратов, что во многих случаях приводит к лекарственной гепатопатии [2, 3]. Однако до сих пор не выявлен сигнальный каскад апоптоза при действии противотуберкулезных препаратов (ПТП) 1-го ряда, а также механизм регуляции данного процесса гепатопротекторами. Цель нашего исследования — изучить механизмы апоптоза гепатоцитов, индуцированного введением ПТП, а также возможное участие гепатопротекторов рунихол и адеметинин в регуляции клеточной гибели. Материал и методы . Работа проведена на крысах-самцах линии Вистар. Поражение печени моделировали введением ПТП в течение 14 сут в следующих дозах: изониазид 50 мг/кг, подкожно+рифампицин 250 мг/кг, внутрижелудочно (в/ж)+пиразинамид 45 мг/кг, в/ж [8]. Гепатопротекторы (рунихол и адеметионин) вводили ежедневно в те же сроки за 1,5 ч до введения ПТП. Рунихол — новый метионин- и сукцинатсодержащий таблетированный препарат, являющийся комплексным субстратным антигипоксантом и гепатотропным средством метаболического действия. В состав препарата входят янтарная кислота, метионин, инозин, таурин. Метионин способен к превращению в организме в адеметионин под действием метионинаденозилтрансферазы (МАТ), является эндогенным донором метильной группы. Адеметионин участвует в биологических реакциях трансметилирования, обеспечивающих текучесть и поляризацию мембран за счет увеличения содержания фосфолипидов, и транссульфатирования, восстанавливающих пул эндогенного глутатиона [11]. Изучены следующие группы, по 6 животных в каждой: 1-я группа — интактные крысы (контрольˇˇˇˇˇˇˇ); 2-я группа — крысы, получавшие ПТП; 3-я группа — крысы, получавшие ПТП+рунихол в/ж 396 мг/кг; 4-я группа — крысы, получавшие ПТП+адеметионин в/ж 230 мг/кг (гепатопротектор, уже используемый в клинике). Все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с директивами Совета Европейских сообществ от 24.11.1986 (86/609/EEC). По окончании эксперимента животных декапитировали и извлекали печень для исследования. После фиксации в 4% формалине образцы печени замораживали для получения криостатных срезов толщиной 6 мкм. Оценивали уровень апоптоза гепатоцитов (метод TUNEL, Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling, нерадиоактивное мечение биотином, выявление диаминобензидином) с использованием терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы для выявления разрывов ДНК (Sileks, Россия). Иммуногистохимически выявляли рецептор CD95, принадлежащий к суперсемейству фактора некроза опухолей с использованием немеченых поликлональных антител к CD95 (Abcam, США). Анализ изображений после выполнения иммуногистохимической реакции и TUNEL выполнен с помощью микроскопа PFM (WPI, США) и видеокамеры DIC-E (WPI, США), Leica DFC 300 FX (Leica, Германия), разрешение 1392×1040 пикселей с последующей денситометрией (VideoTest Software, Россия). Определяли оптическую плотность иммунореактивного вещества в СD95+-клетках на 5–6 срезах печени у каждого животного и группы крыс. Количество апоптотических клеток (TUNELпозитивных гепатоцитов) подсчитывали на 5–6 срезах печени у каждой крысы с последующим определением среднего количества в группе. Для выявления экспрессии апоптоз-ассоциированных молекул в печени проводили Western blotting с немечеными поликлональными антителами к проапоптотическим ферментам каспазе-8 (Abcam, США) и каспазе-3 (Сell Signaling, США), а также с немечеными моноклональными антителами к p53 (Abcam, USA). В качестве контроля количества белка был сделан Western blotting с немечеными моноклональными антителами к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH) (Abcam, США). GAPDH в большом количестве присутствует в клетке и играет важную роль в энергетических процессах, с другой стороны — выполняет много функций, не связанных с гликолизом (регуляция трансляции, ядерный экспорт PHK, репликация и репарация ДНК). Ее используют в качестве контроля содержания белка в пробе при методике Western blotting. Уровень экспрессии изученных белков определяли с помощью денситометрии (ImageJ, США). Для оценки моделируемых патологических процессов и эффективности изученных гепатопротекторов проводили морфологическое описание изменений на срезах печени (окраска гематоксилином – эозином) (БИОЛАМ И, Россия). В связи с однородностью содержания животных в исследуемых группах и невозможностью опровергнуть нулевую гипотезу о нормальности распределения из-за небольшого количества единиц наблюдения в статистической обработке использованы методы, применяемые для нормального распределения данных. Результаты подвергали статистической обработке путем расчета среднего арифметического (x–) и его стандартной ошибки (±sx–). Обработку полученных результатов проводили с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для множественного сравнения выборочных средних. При опровержении нулевой гипотезы о равенстве средних исследуемых групп использовали попарное сравнение с помощью теста Тьюки. Различия считали статистически значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Введение ПТП вызывает дистрофические изменения с отдельными зонами некроза в печени и приводит к увеличению количества гепатоцитов, подвергшихся запрограммированной клеточной смерти (рис. 1). На срезах печени крыс данной группы обнаружено нарушение общей структуры долек, нечеткость радиальности печеночных пластинок. Центральные вены и внутридольковые капилляры сужены. Форма центральных вен искажена, диаметр расширен в сравнении с выявленным в контроле. На отдельных препаратах периваскулярный выпот, лишенный клеточного содержимого. Желчные протоки расширены. В некоторых дольках зоны некроза. Гепатоциты — набухшие, цитоплазма в основном мелкозернистая, реже — гомогенная, слабо базофильная. Размеры округлых ядер увеличены, ядра нередко смещены к периферии гепатоцитов. Характер структурных изменений в печени крыс, получавших ПТП, свидетельствует о развитии дистрофических процессов, вероятно, токсической природы, с отдельными зонами некроза. Что касается топографии дистрофических изменений и зон некроза, то они в разной степени тяжести определяются в периферических частях долек. Однако распределение TUNEL-иСD95-иммунопозитивных клеток не показало какой-либо связи с топографией долек печени. Выявлено, что в условиях токсической гепатопатии (введение ПТП) адеметионин оказывает апоптоз-ингибирующее действие (см. рис. 1, рис. 2). В группе крыс, получавших ПТП, наблюдалось повышение экспрессии CD95 (FAS/APO1) (рис. 3, 4) с одновременным увеличением синтеза каспазы-8 (см. рис. 3). Введение гепатопротекторов не привело к изменению синтеза CD95, однако действие рунихола стимулирует экспрессию каспазы-8 в отличие от адеметионина (см. рис. 3). В данном эксперименте наблюдалось повышение экспрессии р53 в печени у крыс, получавших только ПТП (рис. 5). Ни рунихол, ни адеметионин не индуцируют синтез р53. Отмечена сверхэкспрессия каспазы-3 при возрастании уровня апоптоза гепатоцитов (введение ПТП, а также ПТП одновременно с рунихолом). При этом на срезах печени животных, получавших ПТП и рунихол, наблюдалось уменьшение выраженности патологических явлений. Невысокая экспрессия каспазы-3 при действии адеметионина соответствует низкому уровню апоптоза, так же как и в контрольной группе крыс. Обсуждение полученных данных. Для подбора этиопатогенетически верной терапии лекарственной гепатопатии крайне важно ясно представлять механизмы развития апоптоза гепатоцитов. Как известно, апоптотический сигнал может опосредоваться несколькими путями — поверхностно-рецепторным (внешний), митохондриальным (внутренний), р53-зависимым. В нашем эксперименте показано, что апоптоз является значимым механизмом токсической гепатопатии, вызванной введением ПТП, о чем свидетельствует увеличение доли гибнущих гепатоцитов в сочетании с морфологическими признаками дистрофии печени. Сигнальный каскад апоптоза при введении ПТП включает в себя активацию поверхностных клеточных рецепторов CD95 (FAS/APO1) (член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей — ФНО) и каспазу-8, т. е. апоптоз идет по внешнерецепторному пути. Кроме того, ПТП стимулируют синтез одного из важнейших индукторов апоптоза — онкосупрессора р53 с дальнейшей активацией эффекторной каспазы-3. Действие препарата рунихола осуществлялось посредством внутреннего пути, без активации рецепторов CD95, но с повышением экспрессии каспазы-8 и каспазы-3. Вероятно, таурин, входящий в состав рунихола, ингибирует цитокины, к которым относится и CD95 [1], а также блокирует р53-зависимый путь. Введение рунихола на фоне ПТП предупреждает развитие некроза, улучшая микроструктурное состояние печени, несмотря на то, что уровень апоптоза не снижается. Как известно, процесс апоптоза, в отличие от некроза, протекает без воспаления и, видимо, именно за счет отсутствия воспаления и «прицельной» гибели поврежденных гепатоцитов при введении рунихола наблюдается общее улучшение гистологической картины. Можно предположить, что важную роль играет антигипокcическое и антиоксидантное действие рунихола за счет входящих в его состав янтарной кислоты и инозина, что было показано ранее. Данные свойства янтарной кислоты и инозина имеют большое значение для стабилизации мембран клеток, особенно в условиях патологии [5]. В работах других авторов выявлен антиапоптотический эффект янтарной кислоты — показано снижение уровня апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов крови, снижение содержания в крови ФНО-α [6]. Однако есть и противоположные данные — о стимуляции апоптотической гибели клеток препаратами, в состав которых входит янтарная кислота [7]. Возможно, имеет значение дозозависимый эффект, и предупреждают апоптоз только препараты, содержащие высокие дозы янтарной кислоты. Дозозависимый эффект, вероятно, проявляется также в отношении содержащегося в препарате «Рунихол» метионина, который еще должен превратиться в организме в адеметионин, причем количество его значительно меньше, чем в препарате «Адеметионин». Видимо, метионин в низких дозах не дает апоптоз-ингибирующего эффекта. Выявлено, что в условиях токсической гепатопатии (введение ПТП) адеметионин оказывает апоптоз-ингибирующее действие, причем низкий уровень апоптоза гепатоцитов коррелирует с нормальной экспрессией белка р53 и каспазы-3. По данным литературы, снижение содержания адеметионина приводит к апоптозу клеток. Основным регулятором синтеза адеметионина является МАТ. Ген, кодирующий МАТ, содержит сайт АР-1, который является ключевым регулятором процессов пролиферации и апоптоза [13]. Можно предположить, что супрессия данного гена при какой-либо патологии приводит к снижению экспрессии МАТ, далее — синтеза эндогенного адеметионина, и к повышению уровня апоптоза. Таким образом, результаты эксперимента показали, что экзогенный адеметионин при лекарственной интоксикации снижает повреждение структуры печени, блокируя внешнерецепторный (супрессия синтеза CD95 и каспазы-8) ир53-зависимый пути апоптоза.

About the authors

D. L. Teplyi

Аstrakhan’State University

D. S. Sukhanov

I. I. Mechnikov North-Western Medical University

Email: dmitriysukhanovl@mail.ru

Ye. D. Bazhanova

I. M. Sechenov Institute of Evolu tionary Physiology and Biochemistry

Email: bazhanovae@mail.ru

References

Supplementary files