EFFECT OF HYPOXIC POSTCONDITIONING ON THE EXPRESSION OF ANTIAPOPTOTIC PROTEIN BCL-2 AND NEUROTROPHIN BDNF IN CA1 HIPPOCAMPAL FIELD OF RATS SURVIVING SEVERE HYPOXIA

Full Text

Согласно оценкам Всемирной организации здравоохранения, во всем мире нарушения мозгового кровообращения занимают второе место среди причин смертности и инвалидизации населения после ишемической болезни сердца. Поэтому очевидна необходимость разработки эффективных лекарственных средств и немедикаментозных способов структурно-функциональной реабилитации мозга после повреждающей гипоксии/ишемии. Одним из наиболее перспективных в этом отношении немедикаментозных способов является посткондиционирование (ПостК) - оказание экстремальных воздействий умеренной интенсивности на особей, переживших тяжелое повреждающее воздействие. Феномен ПостК впервые описан на сердце, когда было установлено, что использование кратковременной ишемии на ранних стадиях реперфузии значительно снижает размеры зоны повреждения после перенесенного инфаркта и улучшает выживаемость кардиомиоцитов [16]. В 2006 г. ишемическое ПостК было произведено на мозгу в модели фокальной ишемии на мышах [15]. Недавно был разработан новый, неинвазивный способ ПостК с использованием умеренной гипобарической гипоксии (УГГ) [1]. В моделях на крысах показано, что ПостК 3-кратной УГГ эффективно предотвращает индуцируемую тяжелой гипоксией (ТГ) гибель нейронов гиппокампа и неокортекса, способствует полной функциональной реабилитации после ТГ или психоэмоциональных стрессов, нормализуя активность гормональной системы и поведение у крыс [2, 12]. В настоящее время информации о механизмах, опосредующих протективный эффект ПостК с УГГ, нет. Выдвинута гипотеза, что гипоксическое ПостК модифицирует экспрессию белков, играющих важную роль в процессах нейропротекции и нейропластичности. Наиболее вероятными мишенями, на которые, прежде всего, направлено действие ПостК, являются противоапоптотический белок Bcl-2 и нейротрофический фактор BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor). Как известно, Bcl-2 препятствует запуску апоптоза, опосредуемого митохондриями, за счет ограничения проницаемости наружной митохондриальной мембраны для цитохрома С, а BDNF является полипептидом, ответственным за пролиферацию нейронов, дифференцировку, выживание, синаптическую пластичность, процессы памяти и обучения. Цель настоящей работы - изучение влияния 3-кратного ПостК УГГ на экспрессию Bcl-2 и BDNF в поле СА1 гиппокампа, являющегося наиболее уязвимым для гипоксии/ишемии образованием мозга у крыс, переживших ТГ. Материал и методы. Работа выполнена на взрослых крысах-самцах линии Вистар массой 200-250 г. Животные росли в стандартных условиях вивария Института физиологии им. И. П. Павлова РАН и содержались в лабораторных условиях при свободном доступе к воде и пище. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского Сообщества (86/609/EEC) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. Для создания ТГ животных помещали в барокамеру проточного типа, снижали давление до 160-180 мм рт. ст., что соответствует подъему на высоту 11 000 м. Длительность воздействия - 3 ч. ПостК осуществляли путём 3-кратного воздействия умеренной гипобарической гипоксией (360 мм рт. ст., что соответствует подъёму на высоту 5000 м), длительностью 2 ч, с интервалами 24 ч между сеансами. Первый сеанс проводили через 24 ч после ТГ, поскольку ранее было показано, что это наиболее эффективный режим ПостК [12]. Животных декапитировали через 75 (n=6) и 96 ч (n=6) после ТГ и, соответственно, через 3 (n=6) и 24 ч (n=6) после окончания ПостК (в каждой временной точке проводили контроль). Контрольную группу составили крысы, не подвергавшиеся гипоксии. Для устранения влияния на результаты не связанных с гипоксией условий эксперимента (перенос крыс из клетки в барокамеру) животных контрольной группы тоже помещали в барокамеру на 15 мин, но давление в ней не понижали (по 6 крыс на каждой временной точке). Образцы ткани мозга фиксировали 24 ч в молекулярном фиксаторе FineFix и обрабатывали согласно стандартному гистологическому протоколу. Изготавливали серийные парафиновые срезы мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне -2,80 мм от брегмы. Для оценки экспрессии белков Bcl-2 и BDNF использовали иммуногистохимический метод. Основные этапы метода: 1) инкубация с поликлональными кроличьими антителами к Bcl-2 и BDNF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, США, 1:50); 2) инкубация с вторичными биотинилированными антителами и АВС-комплексом (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Inc, США); 3) визуализация реакции (DAB substrate kit for peroxidase, Vector Laboratories, Inc, США). Анализ препаратов проводили с помощью морфометрической установки, состоящей из светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Германия), цифровой камеры Baumer CX05c (Baumer Optronic, Германия) и компьютера IBM PC с программным обеспечением ВидеоТест-Мастер (Морфология) (Видео Тест, Россия). На основании оценки оптической плотности, иммунопозитивные клетки разделяли на слабо и интенсивно окрашенные (Ni), у которых оптическая плотность была выше средней оптической плотности объекта, в данном случае 0,09 усл. ед. Определяли общее число иммунопозитивных клеток (N) и число Ni-клеток на снимке площадью 460×340 мкм (об. 40). Результаты обрабатывали с помощью пакетов анализа данных STATISTICA 7.0 StatSoft, Inc и Microsoft Excel’2003, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Изменения считали значимыми при P≤0,05. Все результаты представлены в виде среднего арифметического и его стандартной ошибки. Результаты исследования. У не ПостКкрыс количество Bcl-2-иммунопозитивных клеток в поле СА1 гиппокампа через 75 ч после ТГ было значимо ниже, чем у животных контрольной группы, однако количество клеток, интенсивно экспрессирующих этот белок, в данной временной точке значимо не отличалось от контроля. Через 96 ч после ТГ количество Bcl-2иммунопозитивных клеток значимо не отличалось от контроля, но доля интенсивно экспрессирующих пирамидных нейронов снижалась до 20% от таковой в контроле. В дорсальной части гиппокампа через 3 ч после последнего сеанса ПостК (соответственно через 75 ч после ТГ в этой группе) не наблюдалось значимого изменения доли иммунопозитивных клеток по сравнению с контролем. Вместе с тем, количество интенсивно экспрессирующих клеток возрастало в 3 раза. Через 24 ч после завершения 3-кратного ПостК (соответственно через 96 ч после ТГ) общее количество иммунопозитивных клеток, также как и количество Ni-нейронов, было увеличено (рисунок, а, б). Происходило также изменение доли слабо и интенсивно окрашенных клеток от общего количества Bcl-2-иммунопозитивных клеток. Так, в поле СА1 гиппокампа у не ПостК-крыс через 96 ч после ТГ наблюдалось уменьшение относительного содержания интенсивно окрашенных клеток по сравнению с контролем. У животных, переживших ТГ+ПостК, в этой же временной точке происходило увеличение доли Ni-клеток от общего количества нейронов (N) по сравнению с контролем. Тяжелая гипобарическая гипоксия приводила к значимому уменьшению доли экспрессирующих BDNF-клеток в поле СА1 гиппокампа спустя 75 ч после воздействия. Интенсивность экспрессии BDNF не различалась с таковой в контрольной группе. Через 96 ч после воздействия относительное содержание BDNF-иммунопозитивных клеток в дорсальной части гиппокампа нормализировалось, доля интенсивно экспрессирующих клеток также не имела значимых различий с контролем (см. рисунок, в, г). У ПостК-животных выявлено повышение экспрессии BDNF. При анализе соотношения иммунопозитивных клеток с различной интенсивностью окраски выявлено, что в дорсальной части гиппокампа у не ПостК-крыс через 96 ч после ТГ происходило уменьшение доли интенсивно окрашенных клеток от общего количества BDNF-иммунопозитивных клеток по сравнению с контролем. У крыс, переживших ТГ+ПостК, через 24 ч после последнего сеанса гипоксии наблюдалось увеличение доли Ni-клеток от общего количества нейронов по сравнению с контролем. Обсуждение полученных данных. Гипоксия является одним из видов воздействия, нарушающего гомеостаз организма и вызывающего ответную реакцию, направленную на его восстановление. Однако, если эти нарушения слишком велики и клетка не способна их компенсировать, то запускаются механизмы ее повреждения и гибели. Тяжелые формы гипоксии способны вызывать целый ряд функциональных и структурных нарушений, обратимых и необратимых, что зависит от интенсивности и длительности воздействия. Наиболее чувствительны к повреждающему действию гипоксии такие образования мозга, как гиппокамп, в особенности его дорсальная часть, неокортекс и пириформная кора. В настоящем исследовании были подтверждены результаты предыдущих работ о деструктивном влиянии ТГ на нейроны уязвимых образований мозга крыс, сопровождающемся смещением соотношения факторов регуляции выживания/гибели клетки в сторону проапоптотических белков на фоне подавления экспрессии антиапоптотических факторов [11]. Показано, что ТГ приводит к снижению содержания антиапоптотического белка Bcl-2 в поле СА1 гиппокампа даже в поздние сроки после воздействия (75-96 ч), результатом чего становится гибель 30% нейронов данной области через 7 сут после воздействия [12]. Воздействие ПостК УГГ в нашей модели способствовало выживанию нервных клеток [12]. Согласно полученным в данной работе результатам, нейропротективный эффект ПостК может реализовываться за счет вызываемой им отчетливо выраженной активации экспрессии Bcl-2, заключающейся в увеличении как общего количества экспрессирующих Bcl-2 клеток, так и интенсивности его экспрессии отдельными клетками. Сходные данные были получены и в модели раннего ишемического ПостК [14]. Регуляция транскрипции Bcl-2 осуществляется адаптивными транскрипционными факторами CREB, NF-кB [5, 9]. Мобилизация CREB (за счет фосфорилирования) была продемонстрирована при изучении эффекта ишемического [6] и гипобарического [3] прекондиционирования. Следует отметить, что гипоксическое прекондиционирование как ишемическое, так и гипобарическое, увеличивало экспрессию NF-кB, хотя ТГ/ишемия приводили к снижению его экспрессии [3, 4]. По данным литературы, NF-кB и CREB также активируют экспрессию нейротрофина BDNF [7, 10]. В нашем исследовании были получены результаты, согласно которым в поле СА1 гиппокампа у крыс, переживших тяжелую гипобарическую гипоксию с последующим ПостК, происходит значительное увеличение экспрессии этого нейротрофина, что свидетельствует о вероятном участии данного фактора в компенсаторном действии ПостК. Мишенями рецептора BDNF (TrkB) является PI3K (phosphatidylinositide 3-kinases). Известно, что селективное ингибирование PI3K нивелирует нейропротективный эффект ишемического ПостК [13]. Наряду с Akt-сигнализацией, взаимодействие BDNF с рецептором также может приводить к запуску MAP-киназного (Erk1/2) каскада, способствующего активации транскрипции нейропротективных генов [8]. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что реализация нейропротективного действия ПостК УГГ сопровождается индукцией экспрессии Bcl-2 и BDNF, вероятно, выполняющих роль эффекторов нейропротективных процессов, способствующих структурно-функциональной реабилитации мозга после тяжелого повреждающего воздействия.

About the authors

O. V. Vetrovoy

RAMS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: vov210292@yandex.ru

Ye. A. Rybnikova

RAMS I. P. Pavlov Institute of Physiology

T. S. Glushchenko

RAMS I. P. Pavlov Institute of Physiology

M. O. Samoilov

RAMS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: samoilov@pavlov.infran.ru

References

Supplementary files