PECULIARITIES OF REGENERATIVE PROCESSES AFTER THE PLASTY OF OSTEOCHONDRAL DEFECTS WITH COMBINED CELL-TISSUE GRAFTS ON THE BASIS OF AUTOLOGOUS AND ALLOGENEIC CELL СULTURES FROM COSTAL CARTILAGE TISSUE

Full Text

Одной из актуальных медико-биологических проблем остается посттравматическая регенерация гиалинового суставного хряща. При глубоком полнослойном повреждении дефект суставной поверхности восполняется не в полном объёме плотной соединительной тканью или волокнистым хрящом. Возникшая деформация суставной поверхности приводит к развитию дистрофических процессов в тканях, прилежащих к области дефекта. Проблема усугубляется также тем, что применяемые в настоящее время консервативные и хирургические методы лечения, в том числе и мозаичная пластика с использованием аутологичных костно-хрящевых трансплантатов, завершаются формированием не гиалинового, а волокнистого хряща [3, 10]. Именно уникальность структурной организации и трофики суставного гиалинового хряща, прежде всего, ориентирована на выполнение его основной функции - опоры и движения; отсутствие сосудов, нервов и камбия надхрящницы определяют низкий регенераторный потенциал этого вида хрящевой ткани и возможность её восстановления в критических ситуациях только на уровне и в объеме неполной регенерации [6]. Поэтому для решения этой сложной проблемы фундаментальной морфологии и практического здравоохранения необходимы нестандартные подходы. Для замещения дефектов суставной поверхности и транспортировки клеток в область повреждения в настоящее время широко используются различные синтетические и биологические матрицы [8, 9]. Предварительно проведенные экспериментальные исследования на кроликах показали, что без выполнения пластики костно-хрящевых дефектов и при их замещении только биологической матрицей без клеток полноценного восста новления тканей не происходит. Это подтверждается как макроскопическими, так и микроскопическими исследованиями. В этом случае дефекты замещались только костно-фиброзными регенератами [1]. Нами предложен новый способ пластики костно-хрящевых дефектов суставной поверхности комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе аллогенной деминерализованной губчатой кости (спонгиозы) и культур клеток из рёберного хряща [4]. Цель данного исследования - иммунофенотипирование и морфофункциональная характеристика клеток, полученных из реберного гиалинового хряща; оценка и сравнение с позиции регенеративной медицины эффективности пластики костно-хрящевых дефектов суставной поверхности комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе бионосителя с аутологичными или аллогенными клетками из гиалинового хряща ребра. Материал и методы. Работа проведена на базе Самарского государственного медицинского университета в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий. Объектом исследования были кролики породы шиншилла (n=23) обоего пола в возрасте 9-12 мес, массой - 2,5-3 кг. Все исследования осуществляли в рамках международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. Кролики были разделены на 2 экспериментальные группы. Первую группу составили 10 животных, которым проводили пластику дефектов поверхности коленных суставов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами с аутологичными клетками из реберного гиалинового хряща. Вторая группа включала 13 кроликов, которым пластику дефектов проводили комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами с аллогенными клетками из реберного гиалинового хряща. Клетки для трансплантации получали в лаборатории культуры клеток и выращивали по методу М. Brittberg и соавт. [7] в модификации в стандартных условиях в термостате Sanyo-Incubator MIR-162 (Sanyo, Япония) при температуре 37 °С в пластиковых культуральных флаконах площадью 25 см2 (Orange Scientific, Бельгия). После зарастания дна флакона на 80% клетки пересевали стандартным способом. После 4-кратного пассирования получали чистую культуру фибробластоподобных клеток. Все манипуляции с клетками проводили в ламинарном боксе абактериальной воздушной среды БАВп-01 Ламинар-С-1,2 (01) II класса биологической защиты (Ламинарные системы, Россия). Нативную культуру изучали, морфометрировали и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Биолам П - 2-1 (ЛОМО, Россия) при увеличении 100 и 150. Идентификацию клеток проводили с использованием морфологических, гистохимических, морфометрических, иммуногистохимических методов и проточной цитометрии. Для определения функциональных и биологических свойств клеток их окрашивали суданом IV и жировым красным О для выявления включений липидов, по Унна. Для выявления минеральных веществ использовали окраску по Косу, щелочную фосфатазу выявляли по методу Берстона, сукцинатдегидрогеназу (СДГ) - по методу Нахласа, коллаген II типа идентифицировали с помощью моноклональных антител двухэтапным методом [2] (Chondrex, inc., США). Изучали экспрессию маркеров стромальных клеток (CD44, CD90, CD105) и гемопоэтических клеток (CD34, CD45) методом проточной цитометрии (цитофлюориметр Beckton Dickinson FACSCalibur, США) и иммуногистохимии, используя моноклональные антитела (AbD Serаtec, Германия и DAKO Denmark A/S, Дания). Выполняли исследование культур клеток с помощью дифференцировочных сред. Для оценки остеогенной дифференцировки использовали: дексаметазон (10-7 М), аскорбат-2фосфат (50 мг/мл) иβ-глицерофосфат (10 мМ). Для оценки хондрогенной дифференцировки использовали: дексаметазон (10-7 М), аскорбат-2-фосфат (50 мг/мл) и трансформирующий фактор роста (TGFβ1, 10 нг/мл). Все указанные реактивы - производство Sigma-Aldrich (США). Деминерализованную губчатую кость кролика получали по технологии «Лиопласт»® (ЛИОСЕЛЛ, Россия) согласно ТУ 9398-00169101571-2011. С целью получения комбинированных клеточно-тканевых трансплантатов бионоситель помещали на 3-4 сут в культуральные флаконы с клетками, выращенными из реберного гиалинового хряща, а затем выполняли пластику дефектов суставной поверхности. Животных выводили из эксперимента через 2 нед, 1, 3 и 6 мес путем введения им летальной дозы тиопентала натрия. Выполняя артротомию коленных суставов, оценивали макроскопическую картину области пластики. Для гистологического анализа брали дистальный отдел бедренной кости. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заливали в парафин. Изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм на всю глубину блока на роторном микротоме Sakura Accu-Cut SRM200 (Sakura Finetek, Япония). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, крезиловым фиолетовым. Препараты изучали на светооптическом уровне с помощью биологического микроскопа Nikon Alphaphot-2 YS2-H (Nikon, Япония), телеметрически при помощи видеокамеры KCC-31OPD. Результаты исследования. При культивировании клеток уже начиная с 3-х суток после эксплантации фрагментов реберного гиалинового хряща в культуральный флакон наблюдали рост клеток. Они проявляли отчетливо выраженную способность к адгезии ко дну флакона, имели удлиненную форму, 3-5 отростков, анастомозирующих с отростками соседних клеток, центрально расположенное ядро с крупными ядрышками. От фибробластов культивированные клетки отличались характером роста на культуральном пластике, размерами и количеством отростков. Контуры клеток были четко очерчены, цитоплазма была светлая по периферии и более темная гомогенная в центральных зонах вокруг ядер. Морфологические исследования показали, что клетки формировали специфические геометрические фигуры, визуально напоминающие остеоны и вставочные пластинки компактной костной ткани (рис. 1). По морфологическим признакам клетки были расценены как фибробластоподобные, малодифференцированные. При окраске жировым красным О и суданом IV в их цитоплазме выявлялись мелкие включения нейтрального жира. Эти клетки были способны синтезировать коллаген II типа, реакция на щелочную фосфатазу в них была отрицательная. Фенотипирование культивированных клеток с помощью проточной цитометрии и иммуногистохимии показало принадлежность этих клеток к стромальным, об этом свидетельствовала экспрессия маркеров CD44, CD90, CD105 и отсутствие экспрессии на их поверхности маркеров гемопоэтических клеток CD34, CD45. После использования дифференцировочных сред культивирование клеток продолжалось в течение 3 нед, после чего для оценки остеогенной дифференцировки использовали окраску по Коссу, не выявившую минеральных отложений. Клетки давали положительную реакцию на суль-являются прогениторными клетками хрящевого фатированные гликозаминогликаны, что указывает на их хондрогенную дифференцировку. При макроскопическом исследовании зоны -дифферона. Все это свидетельствует, что фибробластопо-пластики дефектов комбинированными транспландобные клетки, выращенные из реберного хряща, татами как с аутологичными, так и с аллогенными клетками из реберной хрящевой ткани в динамике не отличались друг от друга. Трансплантаты полностью восполняли объём дефекта. Начиная с 3-го месяца, суставная поверхность области пластики в обеих группах не отличалась от окружающего гиалинового хряща - была гладкой, блестящей, бело-голубого цвета (рис. 2, а-г). Различия гистогенеза в области пластики дефектов комбинированными трансплантатами с разными типами клеток наблюдали только в ранние сроки. Так, через 2 нед у кроликов, которым выполняли пластику дефектов комбинированными трансплантатами с аллогенными клетками реберного гиалинового хряща, в серийных срезах определялся пористый трансплантируемый материал (рис. 3, а), тесно спаянный с окружающими тканями. Прослеживались контуры рассасывающихся трабекул пересаженной деминерализованной губчатой кости, все пространство которых было заполнено большим количеством фибробластоподобных клеток. Клетки были продолговатой формы с 2-3 отростками, с центрально расположенным округлым ядром и хорошо окрашивающейся цитоплазмой. После пластики трансплантатами с аутологичными клетками реберного гиалинового хряща в этот же срок была отмечена полиморфная картина. Объём дефекта полностью заполняла ткань, представленная большим количеством круглых клеток с центрально расположенным ядром, находящихся в состоянии спонтанной хондродифференцировки. Между круглыми клетками располагались небольшие фрагменты балок рассасывающегося трансплантата (см. рис. 3, б). В глубоких зонах регенерата наблюдалась активная остеобластическая реакция. Через 1 мес после выполнения пластики дефектов комбинированными трансплантатами с аутологичными клетками поверхность регенерата плавно переходила в прилежащий гиалиновый хрящ. Преобладали многочисленные отдельно расположенные мелкие хондроциты, которые не образовывали групп (см. рис. 3, г). В глубоких слоях формировалась грубоволокнистая костная ткань. После пластики трансплантатами с аллогенными клетками область регенерата отличалась полиморфной многоклеточной картиной. Было обнаружено большое количество незрелых клеток, часть которых, более крупные, формировали группы. Поверхностный слой был представлен плоскими клетками, располагающимися в виде пласта (см. рис. 3, в). Наблюдались регенерация и формирование грубоволокнистой костной ткани с большим количеством кровеносных сосудов микроциркуляторного русла. Через 3 мес после пластики дефектов комбинированными трансплантатами в обеих группах животных было отмечено полное восстановление объёма дефектов тканью регенерата. Поверхность области регенерата была ровная. В наружном слое определялись скопления мелких плотно расположенных круглых клеток (хондроид) (см. рис. 3, д, е). Вокруг таких скоплений обнаруживались более крупные клетки. Зонального строения хрящевой ткани ещё не прослеживалось, но уже определялась будущая линия разделения хряща на кальцифицированный и некальцифицированный. Кальцификации глубокого слоя хряща еще не происходило. В субхондральной кости формировалась губчатая костная ткань. Широкие межтрабекулярные лакуны были заполнены костным мозгом. Спустя 6 мес после пластики дефектов комбинированными трансплантатами регенерация была завершена в обеих группах животных - отмечено органотипичное восстановление гиалинового хряща с характерной зональностью его строения, разделением базофильной линией на слои кальцинирующегося и некальцинирующегося хряща (см. рис. 3, ж, з). В зоне, граничащей с субхондрольной костью, хрящевые клетки были крупными, круглыми, матрикс был обызвествлен. Субхондральная пластинчатая костная ткань была сформирована. Обсуждение полученных данных. В ряде исследований показано, что для замещения дефектов суставной поверхности целесообразно использовать клетки из гиалинового хряща, сохранившие свой регенераторный фенотип, способные продуцировать межклеточное вещество, включающее коллаген II типа. Источником получения таких клеток служил суставной хрящ, что приводило к дополнительной травме суставной поверхности [5, 10]. В нашем наблюдении клетки получали не из суставного, а из реберного хряща, используя гетеротопический принцип взятия клеточного материала. В культуре эти клетки имели фибробластоподобную форму с 2-3 отростками, жировые включения в цитоплазме, продуцировали коллаген II типа. При использовании дифференцировочных сред они подвергались хондрогенной, а не остеогенной дифференцировке; давали положительную реакцию на маркеры стромальных клеток CD44, CD90, CD105 и не давали реакции на маркеры гемопоэтических клеток CD34, CD45. Всё это позволило идентифицировать их как прогениторные клетки хрящевого дифферона. В качестве носителей для клеток используют разнообразные материалы как биологического, так и синтетического происхождения [6, 8, 9, 11]. В нашем исследовании была применена биорезорбируемая матрица - деминерализованная губчатая кость, так как мы считаем роль носителя очень важной не только для доставки клеток, но и для восполнения объема дефекта, восстановления анатомической целостности суставной поверхности, пролиферации клеток и формирования в дальнейшем органотипичного гиалинового хряща и субхондральной кости. Сравнительный морфологический анализ области пластики дефектов комбинированными трансплантатами на основе биологической матрицы как с аутологичными, так и аллогенными клетками хрящевой ткани ребер показал, что при различиях в морфологической картине на ранних стадиях гистогенеза к завершению эксперимента в обеих экспериментальных группах происходило восстановление органотипичной структуры как субхондральной кости, так и суставного гиалинового хряща. При этом макроскопическая картина зоны пластики в обеих группах животных была сходной. Таким образом, заполнение костно-хрящевых дефектов суставной поверхности комбинированными трансплантатами на основе деминерализованной спонгиозы как с аутологичными, так и с аллогенными клетками из рёберной хрящевой ткани обеспечивает формирование de novo органотипичного суставного гиалинового хряща и субхондральной кости. Успешное использование аллогенного клеточного материала, сравнимое с применением аутохондроцитов, даёт возможность создания в будущем банков инновационных клеточно-тканевых продуктов для лечения пациентов с посттравматическими костно-хрящевыми дефектами крупных суставов.

About the authors

L. T. Volova

Institute of Experimental Medicine and Biotechnologies; Samara State Medical University

Email: csrl.sam@mail.ru

G. P. Kotel’nikov

Samara State Medical University

Email: info@samsmu.ru

Yu. V. Lartsev

Samara State Medical University

D. A Dolgushkin

Samara State Medical University

Email: dodipesa@yandex.ru

V. V. Boltovskaya

Institute of Experimental Medicine and Biotechnologies; Samara State Medical University

M. A. Terteryan

Institute of Experimental Medicine and Biotechnologies; Samara State Medical University

References

Supplementary files