STRUCTURAL REORGANIZATION OF THE MAIN JOINT COMPONENTS DURING THE EXPERIMENTAL MODELING OF OSTEOARTHROSIS WITH REDUCED BLOOD SUPPLY

Full Text

Остеоартроз у человека и разных видов животных описывается как характерный комплекс клинических признаков (боль, ограничение движений) и патологических изменений тканей сустава (деструкция хряща, синовит, изменения субхондральной кости и суставной капсулы) [12]. Разнообразие биологических моделей спонтанного и индуцированного остеоартроза отражает общепринятые представления о полиэтиологичном характере этого заболевания [12]. Однако, несмотря на полиэтиологичность дегенеративнодистрофических заболеваний костей и суставов, их патогенез почти при всех поражениях имеет васкулярную природу [4]. С учётом данных о роли сосудистой патологии в инициации и прогрессировании остеоартроза разработана экспериментальная модель [7], сочетающая два патогенетических фактора - иммобилизацию сустава и редуцированное кровоснабжение конечности. По мнению некоторых авторов, поражение суставного хряща при остеоартрозе является первичным; изменения субхондральной кости и синовиальной оболочки вторичны [15]. Другие исследователи утверждают, что изменения субхондральной кости и синовиальной оболочки возникают на ранних стадиях заболевания [10]. В модели остеоартроза с редуцированным кровоснабжением конечности [5, 9] отчетливо выраженные изменения субхондральной кости были выявлены уже через 28 сут. Синовиальная оболочка - наименьшая по массе и объему, играет, безусловно, большую роль в состоянии суставного хряща [2], но её изменения в разработанной модели остеоартроза не изучены. Изложенное определяет актуальность комплексных исследований структур сустава при биомоделировании остеоартроза. Цель настоящего исследования - оценка структурной реорганизации синовиальной оболочки, суставного хряща и субхондральной кости коленного сустава у собак при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением. Материал и методы. Исследование проведено на 5 интактных (контроль) и 5 подопытных взрослых собаках, которым перевязывали поверхностную бедренную артерию, коленные суставы фиксировали в среднефизиологическом положении с помощью аппарата Илизарова [7]. Животных выводили из опыта через 28 сут иммобилизации. Содержание, оперативные вмешательства и эвтаназию передозировкой барбитуратов проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказы № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г., № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г.) и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986). Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова. Исследовали парафиновые срезы мыщелков бедра, окрашенные гематоксилином - эозином, по Массону. С помощью рентгеновского электронно-зондового микроанализатора INСA Energy 200 (Oxford Instrumets Analytical, Англия), смонтированного на сканирующем электронном микроскопе JSM-840 (Jeol, Япония), определяли концентрацию серы (ωS, вес. %) и кальция (ωСа, вес. %) в суставном хряще и в субхондральной кости. Для изучения сосудистого русла субхондральной зоны использовали методику инъекции кровеносных сосудов 10% раствором желатина с тушью с последующим препарированием и просветлением препаратов. Рельеф суставной поверхности исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) JSM-840 (Jeol, Япония). Кроме того, готовили полутонкие эпоксидные срезы толщиной 0,5-1,0 мкм увеличенной площади (4-8 мм2) синовиальной оболочки, которую иссекали из супрапателлярной зоны и суставного хряща с подлежащей субхондральной костью с нагружаемых поверхностей мыщелков бедра. Препараты окрашивали метиленовым синим-основным фуксином и исследовали, используя фотомикроскоп (Оpton, Германия). Гистоморфометрические исследования выполнены с помощью АПК «ДиаМорф» (Россия) и программы ВТ-Мастер-Морфология (ВидеоТест, Россия). Определяли толщину покровного слоя синовиальной оболочки (мкм), количество рядов синовиальных клеток, численную плотность микрососудов (мм-2). Выраженность синовита оценивали по шкале экспертных оценок, предложенной V.Krenn и соавт. [11]. Определяли также толщину суставного хряща (мкм), объемную (VVch,%) и численную (NAch, мкм-2) плотность хондроцитов, рассчитывали долю хондроцитов в составе изогенных групп, %) от общего количества(NNis.gr.хондроцитов и долю пустых лакун (NNem.lac., %) от общего количества лакун [8]. Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения и объема выборок значимость различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона, используя программу AtteStat (тесты запрограммированы И. П. Гайдышевым [3] и помещены в динамически подключаемую библиотеку программы Microsoft Excel 97). Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. В синовиальной оболочке отмечена очаговая гиперплазия покровного слоя (рис. 1, а). Его утолщение формировалось за счёт возрастания размеров клеток, количества клеточных слоёв (таблица) и увеличения представительства синовиоцитов макрофагального типа с разрастаниями ворсин, различимыми на светооптическом уровне. Ядра таких клеток расположены эксцентрично, цитоплазма вакуолизирована, с зернистыми включениями (см. рис. 1, б). Отмечены плазматические клетки. В верхних слоях субсиновиального слоя выражен липоматоз, в глубоких - имеются признаки отека с редким расположением и разволокнением коллагеновых волокон, увеличением оптических пустот между ними. Численная плотность кровеносных сосудов субсиновиального слоя по сравнению с контролем значимо (P<0,05) снижена (см. таблицу). Их просветы сужены, стенки утолщены за счёт внутриклеточного отёка, во многих эндотелиоцитах наблюдался кариорексис. Содержание периваскулярных тучных клеток было умеренно повышено (см. рис. 1, в). Нередки сосуды микроциркуляторного русла с облитерированными или тромбированными просветами. В артериях малого калибра преобладали булавовидный фенотип эндотелия, вакуольная дистрофия гладких миоцитов. В нервах субсиновиального слоя выявлен отёк эндоневрия, осевых цилиндров безмиелиновых волокон, многие миелиновые волокна находились в состоянии аксональной атрофии или дегенерации (см. рис. 1, г). В субхондральной зоне кости при анализе просветленных препаратов выявлена гиповаскуляризация (рис. 2, а), при светооптическом исследовании полутонких срезов отмечены признаки нарушения микроциркуляции - стаз эритроцитов, расширенные просветы капилляров и венул. В нагружаемых участках на границе с кальцифицированным хрящом отмечено очаговое усиление костеобразования, утолщение костных трабекул, на поверхности которых были выявлены активные остеобласты (см. рис. 2, б). В менее нагружаемых участках обнаружены признаки угнетения активности остеобластов, преобладания явлений остеокластической резорбции (см. рис. 2, в). Содержание кальция было значимо (Р<0,05) снижено до 10,09±0,01% по сравнению с таковым в контроле (21,8±1,9%). Содержание серы в разных участках изменялось от 0,11±0,04 до 0,35±0,08% (контроль - 0,23±0,05%). При исследовании суставной поверхности в СЭМ выявлено её эрозирование и разволокнение (рис. 3, а). При микроскопии полутонких срезов отмечено, что бóльшая часть хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща находились в состоянии гибели. В промежуточной и глубокой зонах дистрофическим изменениям и дегенерации подвергались как одиночно расположенные хондроциты, так и входившие в состав изогенных групп (см. рис. 3, б). Выявлено неравномерное окрашивание базофильной линии, ее фрагментация, образование разрывов, проникновение костномозгового паннуса в хрящ (см. рис. 3, в). Отмечено значимое (Р<0,05) уменьшение толщины хряща (опыт - 318,6±2,7 мкм; контроль - 475,5±1,3 мкм). Снижение NAch происходило за счет уменьшения (Р<0,05) численности клеток в поверхностной (опыт - 7,0±0,9; контроль - 8,2±1,0) и промежуточной (опыт - 2,89±0,19; контроль - 4,4±0,6) зонах, в глубокой зоне различия между показателями в опыте и контроле были незначимы. Объемная плотность хондроцитов во всех зонах почти в 2 раза была ниже контроля (опыт - 4,6±0,4%; контроль - 9,03±1,5%). Увеличивалась доля пустых лакун (опыт - 43,39%; контроль - 14,5%), если в контроле пустые лакуны были отмечены преимущественно в поверхностной и глубокой зонах, то в опыте - в промежуточной зоне. Выявлено значительное снижение содержания серы (опыт - 0,70±0,020 вес.%, контроль - 1,260±0,020 вес.%). Зарегистрировано увеличение содержания кальция, особенно в промежуточной и глубокой зонах (опыт - 0,27±0,05 вес.%, контроль - 0,19±0,03 вес.%). Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования получена морфологическая характеристика индуцированного деструктивно-дистрофического процесса в коленном суставе у собак. Гистологические и метаболические изменения суставного хряща соответствовали начальным стадиям остеоартроза - степень I-III по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI [14], сопровождались синовитом, гиповаскуляризацией и денервацией субсиновиального слоя, а также значительными изменениями субхондральной кости. Оценка по шкале V. Krenn и соавт. [11] в нашем эксперименте свидетельствовала об отчетливо выраженном синовите (6-7 баллов). Известно, что симптоматика остеоартроза у людей в значительной степени определяется неинфекционным воспалением синовиальной оболочки [13]. В субхондральной кости отмечались ухудшение васкуляризации, усиление костной резорбции, выявлены очаговый остеосклероз и существенное снижение содержания кальция. В клинических исследованиях установлено увеличение скорости обеих составляющих ремоделирования костной ткани - резорбции и костеобразования - при остеоартрозе; преобладание какого-либо составляющего зависит от стадии заболевания [1, 6]. Результаты выполненного исследования свидетельствуют о том, что разработанная экспериментальная модель остеоартроза клинически адекватна и пригодна для доклинических испытаний различных терапевтических стратегий при остеоартрозе - в том числе направленных на купирование синовита либо модификацию ремоделирования субхондральной кости.

About the authors

T. A. Stupina

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: StupinaSTА@mail.ru

N. A. Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: nshchudlo@mail.ru

M. A. Stepanov

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

References

Supplementary files