DEMONSTRATION OF THE GLOMERULI IN HUMAN CEREBELLUM USING SYNAPTOPHYSIN IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND CONFOCAL LASER MICROSCOPY

Full Text

Мозжечок осуществляет контроль координации и двигательной активности за счет комплексного взаимодействия возбуждающих и тормозных систем с участием собственных ядер мозжечка [1]. Первым афферентным звеном в этой системе являются особые синаптические образования - клубочки, расположенные в зернистом слое коры мозжечка. Клубочки имеют сложное строение: в их состав входят дендриты зернистых клеток, моховидные волокна и аксоны больших звездчатых нейронов (клеток Гольджи) [6], образующие синаптические комплексы. Исследование структурной организации клубочков в основном осуществляется посредством электронной микроскопии, требующей трудоемких способов обработки материала. Для функциональной интерпретации состояния синаптических структур клубочков мозжечка может быть полезным иммуноцитохимическое выявление синаптофизина - гликопротеина, являющегося неотъемлемой частью стенки синаптических пузырьков. Он синтезируется в цитоплазме нейрона и транспортируется в синаптические терминали. Поэтому синаптофизин нередко используют при изучении синаптогенеза [7]. Важным свойством синаптофизина является его высокая устойчивость к аутолизу [8], что обусловливает его пригодность для изучения синаптичеких структур у человека, подтвержденную данными, полученными при изучении периферической нервной системы [3-5]. Цель настоящего исследования - выяснение возможности использования иммуноцитохимической реакции на синаптофизин для анализа структурной организации клубочков мозжечка у человека при помощи световой и конфокальной лазерной микроскопии. В работе использованы парафиновые блоки мозжечка человека (n=8, возраст 20-62 года) из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины. Материал был фиксирован в цинк-этанолформальдегиде [2] и обработан по общепринятой методике. Из полученных блоков готовили срезы толщиной 7-12 мкм. Для выявления синаптофизина применяли кроличьи поликлональные антитела к синаптофизину человека (Spring Bioscience, США; номер по каталогу E2174). В качестве вторичных реагентов были использованы реактивы из набора EnVision+ HRP/DAB (Dako, Дания) для световой микроскопии. Для конфокальной лазерной микроскопии были использованы первичные мышиные моноклональные антитела к синаптофизину клон SY38 (Dako, Дания; номер по каталогу M0776), вторичные биотинилированные антитела из набора LSAB2 System-HRP(Dako, Дания) и стрептавидин, конъюгированный с флюоресцентным красителем индокарбоцианином (Streptavidin Cy3 Conjugate, Invitrogen, США; номер по каталогу SA1010) в разведении 1:100. В результате применения различных режимов инкубации срезов и подбора вторичных реагентов были разработаны оптимальные (по трудозатратам и качеству получаемых препаратов) протоколы. Протокол для световой микроскопии Удалить из срезов парафин и регидратировать их обычным способом. Промыть срезы в дистиллированной воде в течение 5 мин. Поместить стекла со срезами в стеклянный сосуд (удобно использовать сосуды Хелендахела) с предварительно подогретым в термостате (58-60 ºС) модифицированным цитратным буфером (pH 6,1; номер по каталогу S1700 - Dako, Дания) и подвергнуть процедуре теплового демаскирования антигены в бытовой пароварке (TEFAL, Франция или в любой другой с вертикальным размером паровой камеры 8-10 см) в течение 20 мин. Охладить препараты в остывающем буфере в течение 15-20 мин. Остывшие предметные стекла со срезами промыть дистиллированной водой для удаления остатков демаскирующего раствора (1-2 мин). Поместить в стаканчик с 3% перекисью водорода на 5-10 мин для блокировки эндогенной пероксидазы. Удалить из срезов перекись водорода путем промывки в дистиллированной воде, после чего предметные стекла перенести в 0,01М фосфатно-солевой буфер (ФСБ), pH 7,4 на 5-7 мин. Аккуратно промокнуть стекло вокруг срезов фильтровальной бумагой (для образования сухого поля) и обвести область расположения срезов гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.). Сразу после этого, не допуская подсыхания срезов, нанести на них необходимое количество (100-200 мкл) блокировочного раствора - 5% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA, номер по каталогу А2153, Sigma-Aldrich, США) на ФСБ или готовый блокировочный раствор - Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставить при комнатной температуре на 10 мин. Удалить излишек блокировочного раствора без промывки. Нанести на срезы необходимое для их покрытия количество поликлональных кроличьих антител к синаптофизину в разведении 1:200. После этого поместить стекла во «влажные камеры» для предотвращения испарения реагентов и подсыхания срезов и поставить в термостат (27 ºС) на 60 мин. В качестве «влажных камер» можно использовать любые пластиковые коробки с крышками, например квадратные чашки Петри (100×100×20 мм, номер по каталогу 82.9923.422, Sarstedt, Австралия), на дно которых нужно положить влажную фильтровальную бумагу и стеклянные палочки либо другие подставки для предметных стекол. Смыть антитела промывочным буфером (ФСБ) и поместить стекла в стаканчик с аналогичным буфером на 5-7 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество реагента «HRP Conjugate» из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System (SpringBioscience, США) и поставить в термостат при 27 ºС на 20 мин. На этом этапе можно использовать и другие вторичные реагенты (EnVision+, Dako; MACH2, BioCare), однако время инкубации в этом случае придется увеличить до 30-35 мин. Смыть вторичные антитела промывочным буфером (ФСБ или трис-солевым буфером - ТСБ) и поместить стекла в стаканчик с ФСБ или ТСБ на 5-7 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов, нанести необходимое количество рабочего раствора 3,3’-диаминобензидина (приготовленного при помощи набора DAB+, Dako, Дания, или аналогичных). В течение 1-5 мин происходит образование окрашенного продукта гистохимической реакции. Этот процесс желательно контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона. Смыть раствор хромогена и промыть препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 5 мин в каждой. При необходимости препараты можно докрасить квасцовым гематоксилином (например, гематоксилином Джилла или Майера) в течение 1 мин с подсинением в щелочной воде (1 капля 10% аммиака на 100 мл дистиллированной воды). Обезводить препараты в этаноле восходящей крепости, просветлить в ксилоле обычным образом и заключить в полистирол (пермаунт, DPX или другие подобные среды). Протокол для конфокальной лазерной микроскопии Этапы 1-7 провести аналогично предыдущему протоколу, кроме пункта 5, который не является необходимым и может быть исключен. Удалить излишек блокировочного раствора без промывки. Нанести на срезы необходимое для их покрытия количество мышиных моноклональных антител к синаптофизину в разведении 1:30 клон SY38 (DAKO, Дания; номер по каталогу M0776). После этого поместить стекла во «влажные камеры» для предотвращения испарения реагентов и подсыхания срезов и поставить в термостат (27 °С) на 60-66 ч. Смыть антитела промывочным буфером (ФСБ) и поместить стекла в стаканчик с аналогичным буфером на 5-7 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на них необходимое количество реагента Link из набора LSAB2 System-HRP (Dako, Дания) и поставить в термостат при 27 °С на 180 мин. На данном этапе можно использовать и другие реагенты, содержащие биотинилированные антимышиные антитела. Смыть вторичные антитела промывочным буфером (ФСБ или ТСБ) и поместить стекла в стаканчик с ФСБ или ТСБ на 15-20 мин. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы раствор стрептавидина, конъюгированного с флюоресцентным красителем индокарбоцианином (Streptavidin Cy3 Conjugate, Invitrogen, США; номер по каталогу SA1010) в разведении 1:100 и поставить в термостат при 27 ºС на 30 мин. На этом этапе можно использовать и другие конъюгаты флюоресцентных красителей со стрептавидином. Конъюгат стрептавидина с Cy3 был нами выбран, поскольку он удобен при использовании твердотельного лазера (561 нм), а его флюоресценция соответствует зоне слабой автофлюоресценции фиксированных тканей, что позволяет добиться более четкой визуализации иммунопозитивных структур. Смыть раствор конъюгата промывочным буфером (ФСБ или ТСБ) и промыть стекла в двух сменах дистиллированной воды по 5-7 мин в каждой. Заключить в водорастворимую среду, пригодную для флюоресцентной микроскопии (например, Fluorescent Mounting Medium - Dako, Дания). Данную методику можно использовать для выявления аксонных терминалей и варикозностей, содержащих синаптические пузырьки как в центральной, так и периферической нервной системе человека. В результате просмотра препаратов, окрашенных в соответствии с протоколом № 1 (для световой микроскопии), при малых увеличениях микроскопа (об. 4 и 10) в коре мозжечка наблюдаются 3 отчетливо выраженные, по-разному окрашенные зоны (рисунок, а). Равномерно окрашенная поверхностная зона соответствует молекулярному слою коры мозжечка. Зона, расположенная глубже, является зернистым слоем коры мозжечка, в котором находятся клубочки. Неокрашенная (самая глубокая) зона соответствует белому веществу, что однозначно определяется на докрашенных гематоксилином срезах. Слой грушевидных нейронов при реакции на синаптофизин четко не дифференцируется, поскольку эти клетки не накапливают синаптофизин в перикарионе и дендритах. При использовании иммерсионного объектива (об. 100) в зернистом слое коры мозжечка четко контурируются отдельные клубочки. В их составе определяются отдельные синаптофизиниммунопозитивные гранулы, соответствующие терминалям, которые могут принадлежать как моховидным волокнам, так и аксонам больших звездчатых нейронов [6]. Изображения, полученные при помощи цифровой камеры с недокрашенных препаратов, пригодны для проведения морфометрического и стереологического анализа с использованием специализированных компьютерных программ (например, общедоступной программы Image J, NIH, США). При проведении конфокальной лазерной микроскопии в зернистом слое коры мозжечка отчетливо видны отграниченные друг от друга флюоресцирующие структуры (см. рисунок, б), состоящие из скоплений гранул различной формы, которые имеют неодинаковые размеры (0,1-2 мкм). Эти структуры по местоположению и форме соответствуют клубочкам мозжечка, обнаруживаемым при проведении иммуноцитохимической реакции на синаптофизин и микроскопии в проходящем свете. На одиночном оптическом срезе, полученном при высоком разрешении конфокального микроскопа, видно, что клубочки представляют собой сложные комплексы, напоминающие изогнутые цепочки, образованные отдельными синаптофизин-иммунопозитивными гранулами (см. рисунок, в). Таким образом, обработка препаратов в соответствии с представленными протоколами позволяет выявлять синаптофизин-иммунопозитивные структуры клубочков мозжечка человека при использовании фиксированного в цинк-этанолформальдегиде аутопсийного материала и получать препараты, пригодные для проведения компьютерного количественного анализа.

About the authors

Ye. G. Gilerovich

RAS Institute of Experimental Medicine

Ye. G. Sukhorukova

RAS Institute of Experimental Medicine

O. V. Kirik

RAS Institute of Experimental Medicine

I. P. Grigoriyev

RAS Institute of Experimental Medicine

D. E. Korzhevskiy

RAS Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

References

Supplementary files