CHANGES IN THE NUMBER OF REGENERATING MYELINATED FIBERS IN INJURED NERVE OF THE RAT AFTER ALLOTRANSPLANTATION OF THE DISSOCIATED CELLS OF THE EMBRYONIC CNS ANLAGES

Full Text

Поиск способов восстановления поврежденных периферических нервов является одной из актуальных нейробиологических и клинических проблем. В настоящее время для улучшения восстановления поврежденных нервных проводников активно ведутся экспериментальные разработки клеточных технологий с использованием стволовых клеток (CК) [9, 17]. Считается, что СК, выступая в качестве источника трофических и ростовых факторов, могут создавать благоприятное микроокружение для регенерирующих аксонов. В отдельных исследованиях продемонстрировано стимулирующее влияние на рост нервных волокон реципиента фрагментов эмбриональных закладок ЦНС, в частности спинного мозга [19]. Другие исследователи отмечают такой эффект только в случае использования диссоциированных клеток, полученных из этих закладок [6]. Ранее было показано, что полученные в результате диссоциации и пересаженные в поврежденный нерв клетки выживают в течение нескольких недель после операции, и часть из них дифференцируются в нейроны, содержащие маркер зрелых нейронов, ядерный белок NeuN [7]. Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование влияния диссоциированных клеток, полученных из эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга, на рост регенерирующих нервных волокон поврежденного нерва реципиента. Материал и методы. В работе использованы крысы линии Вистар (6 самок и 36 самцов) массой 200-250 г. Содержание животных и все эксперименты осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). У эмбрионов крыс на 15-е сутки развития выделяли фрагменты дорсолатеральной стенки переднего мозгового пузыря и шейного отдела спинного мозга - закладок, в которых, как известно, содержатся нейральные стволовые/ прогениторные клетки (НСПК). Для получения суспензии НСПК выделенные эмбриональные закладки помещали в культуральную среду 199 (Биолот, Россия), содержавшую 0,2% химопсина (Самсон-Мед, Россия), на 10 мин (37 ºС), затем фрагменты закладок пипетировали, взвесь клеток дважды отмывали средой без химопсина, центрифугируя в течение 15 мин (200 g). Осадок ресуспендировали в 1 мл свежей среды [6, 7] и вводили субпериневрально в проксимальную часть поврежденного седалищного нерва. Нерв повреждали путем наложения лигатуры на 40 с по методу, предложенному М. Е. Мирошниковой и Е. И. Чумасовым [4]. Прооперированные животные были разделены на 6 экспериментальных групп (табл. 1). Выбор сроков исследования (21 и 60 сут) связан с особенностями дегенеративных и репаративных процессов, происходящих в периферических нервных проводниках после повреждения. В более ранние сроки после передавливания в дистальных отделах нервных стволов наблюдается валлеровская дегенерация (ВД). Характерные для нее процессы и образование продуктов распада миелина затрудняют количественную оценку тонких регенерирующих волокон [4, 5]. К 21-ми 60-м суткам продукты распада миелина удаляются макрофагами, и в дистальном отделе поврежденных нервов определяются уже миелиновые нервные волокна, что позволяет осуществлять их количественную оценку на светооптическом уровне (рисунок). Миелиновые регенерирующие нервные волокна седалищного нерва крысы через 60 сут после наложения лигатуры и введения диссоциированных клеток переднего мозгового пузыря (а) и спинного мозга (б) 15-суточного эмбриона крысы. Животных умерщвляли передозировкой паров этилового эфира, выделяли фрагменты дистального сегмента нерва на расстоянии 0,5 см от места наложения лигатуры и фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, дофиксировали в растворе 2% четырехокиси осмия, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, пропиленоксиде и заливали в эпон. Изготавливали поперечные полутонкие срезы толщиной 1 мкм и окрашивали толуидиновым синим. Анализ числа миелиновых регенерирующих волокон на стандартной единице площади осуществляли, используя метод оценки эффективности регенерации нерва, описанный рядом авторов и выполняемый на полутонких срезах [1, 4, 5, 10]. Регенерирующие нервные волокна подсчитывали на цифровых изображениях, полученных при помощи микроскопа Leica DM 750 (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ICC 50 (Leica, Германия). Количественный анализ миелиновых нервных волокон проводили на 6 цифровых изображениях площадью 12 884,18 мкм² при ув. 1000. Для подсчета использовали программу ImageJ (NIH, США). О значимости различий судили по величине t-критерия и U-критерия и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Изучение поперечных полутонких срезов дистального отдела поврежденных нервов крыс I экспериментальной группы (контроль) выявило структурные изменения, характерные для регенерирующего нерва. В этот срок в макрофагах еще можно видеть остатки продуктов распада миелина. Эпиневрий в области повреждения утолщен, в нем наблюдается разрастание кровеносных сосудов. В нервном стволе определяются большое число регенерирующих миелиновых нервных волокон. Через 60 сут после наложения лигатуры (IV группа) плотность их расположения значимо возрастает (табл. 2). Анализ нервных стволов у животных II и III экспериментальных групп показал, что по сравнению с контролем (наложением лигатуры) количество регенерирующих нервных волокон не изменено (см. табл. 2). В экспериментальной группе VI в дистальном сегменте нерва у реципиента число нервных волокон по сравнению с контролем (наложение лигатуры) значимо возрастает, а в группе V этого не наблюдалось (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. Проведенный анализ количества нервных волокон на единице площади нервного ствола в разные сроки после наложения лигатуры показал, что через 60 сут оно приблизительно в 2 раза выше, чем через 21 сут. Аналогичные результаты были получены в работах, выполненных ранее на сходной модели повреждения седалищного нерва крыс [4]. В настоящем исследовании показано, что под влиянием диссоциированных клеток, полученных из спинного мозга эмбриона и введенных в передавленный нерв, число регенерирующих миелиновых волокон в дистальной его части возрастает по сравнению с контролем. Сопоставляя полученные результаты с данными литературы, можно высказать три предположения о механизмах отмеченного влияния клеточной терапии на рост нервных волокон. Первая гипотеза связана со способностью применяемых для трансплантации клетокпредшественников вырабатывать и секретировать ростовые и трофические факторы. Известно, что регенерация аксонов в поврежденных нервных проводниках определяется их микроокружением [5, 14, 18]. Последнее зависит от функционирования эндогенных клеточных элементов нерва: макрофагов, клеток стенки кровеносных сосудов, клеток эндо-, пери-и эпиневрия и, главным образом, нейролеммоцитов (шванновских клеток). Рост регенерирующих нервных волокон находится в зависимости от концентрации трофических факторов, цитокинов и белков межклеточного вещества, секретируемых нейролеммоцитами [14, 18]. Внесение в место повреждения экзогенных клеточных элементов, обладающих высокой секреторной активностью, приводит к изменению микроокружения и может оказывать стимулирующее влияние на репаративные процессы. В частности, применение мезенхимных стволовых клеток (МСК) приводит к увеличению пролиферативной активности эндогенных нейролеммоцитов и повышению секреции ими биологически активных веществ (фактора роста нервов и др.) [14, 18]. НСПК, как и МСК, вырабатывают ряд ростовых факторов [13, 15, 16], которые могут создавать благоприятное микроокружение для роста аксонов и положительно влиять на функционирование собственных клеток нерва. Кроме того, некоторыми авторами отмечено, что применение клеточной терапии поврежденного нерва оказывает нейропротективное действие и препятствует ретроградной дегенерации нейронов соответствующих сегментов поясничного отдела спинного мозга и чувствительного ганглия [3, 11]. Вследствие увеличения числа сохранившихся нейронов количество волокон на периферии может возрастать. Вторая гипотеза о механизмах влияния пересаженных клеток на регенерацию поврежденного нерва также связана с их трофическим воздействием на восстановление нервных волокон. Она основана на том факте, что при передавливании нервного ствола зажимом или с помощью наложения лигатуры есть вероятность, что не все нервные волокна дистального сегмента подвергаются ВД. Часть тонких волокон могут сохраняться на всем своем протяжении. Возможно, под влиянием клеточной терапии сохраняется бóльшее количество волокон реципиента. Подтверждением этого предположения служат результаты работы М. Н. Карагяура [2], показавшего, что при клеточной терапии МСК, полученными из жировой ткани, число волокон, содержащих нейрофиламенты, возрастает по сравнению с таковым в контроле (повреждение нерва без применения МСК) уже через 7 сут после травмирования, т. е. клеточная терапия может способствовать повышению устойчивости к повреждению травмированных нервных волокон. Одним из факторов, стимулирующих восстановление волокон, является нейротрофический фактор головного мозга, вырабатываемый МСК [2]. Третья гипотеза базируется на наблюдении, которое было сделано при пересадке фрагментов эмбриональных закладок ЦНС в полностью изолированный от проксимальной части дистальный отдел перерезанного нерва, в место, где отсутствуют собственные нервные волокна реципиента [8]. Было показано, что только аксоны мотонейронов, развивающихся в тканевых трансплантатах спинного мозга, в отличие от нейронов неокортекса, способны выходить за пределы трансплантатов и расти на периферию. Имеются данные, что развивающиеся в нерве нейроны спинного мозга могут реиннервировать соответствующую мышцу и предотвращать ее атрофию [12]. Вероятно, в нашем случае часть подсчитанных аксонов в дистальной части нерва принадлежат пересаженным клеткам - дифференцирующимся в изученные сроки в мотонейроны. Однако ранее было показано, что число нейронов суспензионных трансплантатов, выживших через 3 нед после пересадки, невелико [7]. В связи с этим мы полагаем, что более вероятна первая гипотеза о механизмах влияния пересаженных клеток, которые стимулируют рост собственных регенерирующих волокон нерва реципиента. Вопрос о том, почему стимулирующее влияние на регенерирующие волокна нерва оказывают суспензионные трансплантаты спинного мозга, но не неокортекса, спорен. Клеточный состав разных эмбриональных закладок неодинаков. Трансплантаты спинного мозга 15-суточных зародышей содержат более дифференцированные клетки-предшественники, чем трансплантаты переднего мозгового пузыря. Возможно, способности вырабатывать трофические и ростовые факторы у этих трансплантатов различны. Таким образом, в настоящем исследовании показано, что введение в поврежденный нерв диссоциированных клеток эмбриональных закладок спинного мозга, но не неокортекса, приводит к увеличению числа миелиновых регенерирующих волокон в дистальном конце нерва у реципиента. Выяснение возможных молекулярных и клеточных механизмов этого явления требует дальнейших исследований.

About the authors

Ye. S. Petrova

North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Laboratory of the Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

Ye. N. Isayeva

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Laboratory of Immunopharmacology

References

Supplementary files