STRUCTURAL CHARACTERISTICS AND SPATIAL ORGANIZATION OF THE PARVALBUMIN-CONTAINING NEURONS OF THE SOMATOSENSORY AREA OF THE SI CEREBRAL CORTEX IN RATS

Full Text

Тормозная система коры большого мозга играет доминирующую роль в регуляции функционального состояния как отдельных корковых колонок, так и мозга в целом [5]. В настоящее время выделяют до 21 типа тормозных нейронов, имеющих различные морфологические особенности, происхождение, спайковую активность, а также разнообразные добавочные нейропептиды [4]. Парвальбумин (PA) является кальций-связывающим внутриклеточным протеином, характерным почти для 40% всех ГАМКергических интернейронов ЦНС, основными функциями которого являются участие в высвобождении нейромедиатора, а также стабилизация содержания внутриклеточного кальция после реполяризации клетки. Интернейроны неокортекса, содержащие PA, являются быстроспайковыми и происходят из временной структуры, присутствующей на эмбриональной стадии развития и являющейся зачатком базальных ганглиев - ганглионарного бугорка [2]. Интерес к исследованию этой группы тормозных интернейронов возрос за последние несколько лет: от единичных работ в 1986-1987 гг. до полутора тысяч публикаций, индексируемых в PubMed только в 2014 г. [8]. По современным данным PA-содержащие нейроны в коре большого мозга способны формировать несколько нейронных сетей, соединенных как химическими, так и электрическими синапсами, при этом, функциональное назначение этих сетей, а также их связь с колончатой организацией неокортекса требует дальнейшего выяснения [1, 7]. Исследование структурно-функциональной организации и морфологическая характеристика PA-содержащих, предположительно, ГАМКергических быстроспайковых нейронов корковых колонок может способствовать пониманию их роли в процессах торможения, синхронизации и регуляции ритмогенеза как коры, так и подкорковых структур. Цель настоящей работы - послойное морфометрическое исследование нейронов, содержащих РА сомато-сенсорной зоны SI неокортекса у крыс. Материал и методы. Исследование проведено на беспородных лабораторных белых крысах (n=10) обоего пола массой 150-200 г. Содержание животных и экспериментальные исследования осуществлялись в соответствии с протоколом, утвержденным Комиссией по биоэтике Южного федерального университета 18.04.2012 г. Объектом исследования являлась соматосенсорная зона коры (SI). Под глубоким эфирным наркозом, после внутривенной инъекции гепарина животным проводили транскардиальную перфузию фосфатным буфером, затем раствором 4% параформальдегида с 0,05% глутаральдегидом на фосфатном буфере. Через 2 ч после окончания перфузии головной мозг извлекали и оставляли для дофиксации в холодильнике при температуре 4 ºС в фиксирующем растворе на всю ночь. Тангенциальные и фронтальные срезы толщиной 60 мкм изготавливали на вибратоме VT 1000E (Leica, Германия). После криопротекции в 30% сахарозе на фосфатном буфере срезы мгновенно замораживали над парами жидкого азота, затем размораживали в фосфатном буфере и инкубировали 4 сут при температуре 10 ºС с первичными моноклональными антителами к РА (Sigma, Швеция) в разведении 1:100, 1:1000. После промывки в фосфатном буфере срезы инкубировали во вторичных антителах RTU Envision Flex/HRP (Dako, Германия) всю ночь. Для проведения иммуногистохимической реакции на тонких срезах мозг заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 4 мкм, которые помещали на стекла с полилизиновым покрытием и далее инкубировали с первичными моноклональными антителами к РА (Sigma, Швеция) в разведении 1:100. Как для тонких срезов, так и для срезов толщиной 60 мкм, выявление иммунных комплексов проводили с использованием системы визуализации Dako EnVision System+Peroxidase (DAB) (Dako, Германия). Срезы толщиной 60 мкм после дополнительной фиксации 1% четырехокисью осмия и обезвоживания заливали плоскопараллельным методом в эпоксидную смолу. Полученные срезы (тонкие 4 мкм и толстые 60 мкм) изучали под светооптическим микроскопом Leica 2500 (Leica, Германия) со встроенной цифровой камерой Leica DFC 495. Подсчет количества нейронов и их отростков проводили только на срезах толщиной 60 мкм, поскольку это позволяло идентифицировать большее количество клеток, чем на тонких срезах толщиной 4 мкм. Морфометрию проводили при помощи модуля интерактивных измерений (LAS Interactive Measurement) лицензионной программы Leica Application Suite 4.3 (Leica, Германия). Подсчет РА-позитивных (PA+) нейронов проводили на 4 фронтальных срезах толщиной 60 мкм на площади 10 000 мкм2 в каждом слое коры. Всего во всех слоях было подсчитано 360 иммунопозитивных клеток. Было также оценено количественное распределение PA+-нейронов в зоне формирования баррелей коры (IV слой), поскольку этот слой, как было нами обнаружено, содержит наибольшее количество исследуемых клеток. После идентификации баррельной коры PA+-нейроны были подсчитаны между баррелями (в септах), в стенках и во внутренней части каждого барреля. Всего было подсчитано 748 иммунопозитивных клеток в 10 баррелях на площади 519 710,3 мкм2. Результаты исследования. При светооптическом исследовании как на толстых, так и на тонких фронтальных срезах после иммуногистохимической реакции практически во всех слоях соматосенсорной зоны коры SI обнаруживаются множество интенсивно окрашенных клеток с разнонаправленными отростками, экспрессирующими исследуемый антиген РА (PA+-нейроны). Проведенное исследование выявило локализацию продуктов реакции в цитоплазме, в ядре, а также в аксонах и дендритах исследуемых нейронов. IV слой коры определяется в виде зоны с более плотным содержанием PA, что лучше видно на толстых срезах (рисунок, а, в). При больших увеличениях отмечено, что этот эффект обеспечивается скоплением в области формирования баррелей тел PA+-нейронов, а в нейропиле - многочисленных пересечений отростков этих клеток (см. рисунок, г). Вокруг PA-негативных клеток наблюдается образование темного ободка - вероятно в результате формирования дендро-соматических и аксо-соматических синаптических контактов между отростками PA+-нейронов и телами других нейронов. При изучении как тонких, так и толстых срезов отмечено морфологическое различие тел PA+-нейронов, а также характера ветвления их отростков (см. рисунок, б, д-з). По форме тел PA+-нейроны в различных слоях коры могут быть разделены на звездчатые, вытянутые, округлые и треугольные, а по характеру их отростков на униполярные, биполярные и мультиполярные с ветвящимися дендритами (см. рисунок, б). Для I слоя коры в основном характерны нейроны, площадь сечения тел которых не превышает 60 мкм2. II слой коры содержит PA+-нейроны с более широким разбросом площадей тел, чем слой I, но доминируют клетки с диапазоном площади тел 60-90 мкм2. Как в III, таки в IV слое коры представлены различные по строению PA+-нейроны с площадью тел от 60 до 180 мкм2. В V и VI слоях находятся нейроны с наибольшим разбросом площадей их тел: половина PA+-нейронов в этих слоях имеют крупные тела - 150-360 мкм2, другая часть клеток имеют меньшие размеры - 30-120 мкм2. В целом, исследование площади тел PA+-нейронов в разных слоях коры демонстрирует тенденцию увеличения размеров клеток по направлению к ее глубоким слоям. При послойном подсчете PA+-нейронов на фронтальных срезах толщиной 60 мкм на площади 10 000 мкм2 в каждом слое коры было обнаружено, что из всех подсчитанных 360 иммунопозитивных клеток, 47,1% располагались в IV слое, во II слое - 8,3%, в III слое - 10,9%, в V слое - 17,1%, в VI слое - 14%. Наименьшее количество PA+-нейронов находилось в I молекулярном слое коры - 2,6% от всех учтенных PA+-нейронов. На тангенциальных срезах толщиной 60 мкм на площади 519 710,3 мкм2 среди всех подсчитанных в баррельной зоне PA+-нейронов (748 клеток) наибольшее их содержание было обнаружено между баррелями - в септах - 43%, в стенках баррелей 26%, во внутренней части барреля - 31% (см. рисунок, и). При этом, PA+-нейроны плотнее расположены в стенке барреля (12±8 клеток на 10 000 мкм2), чем в его внутренней части (5,0±2,2 клетки) и в септах (4,2±1,7 клетки). Обсуждение полученных данных. Существуют несколько классификаций ГАМКергических интернейронов ЦНС. Они могут быть дифференцированы на основании функциональных электрофизиологических характеристик, по типу формирования синаптических контактов с телами и отростками других клеток, по времени и месту происхождения из ганглионарного бугорка, по типу прорастания аксона интернейрона и др. [4]. Наиболее общепринятыми являются классификации тормозных интернейронов по экспрессии молекулярных маркеров, таких как соматостатин, холицистокинин, нейропептид Y и по экспрессии Ca2+-связывающих протеинов, среди которых кальбиндин, кальретинин, PA [5, 13]. Нейроны, содержащие PA, по существующим данным, представлены двумя основными морфологическими группами: аксо-аксональные или «канделяброподобные» (axo-axonal, chandelier cells), осуществляющие пресинаптическое торможение на начальном сегменте аксонов пирамидных нейронов, и мультиполярные корзинчатые (basket cells), формирующие синаптические контакты на проксимальной части дендрита [6]. Однако проведенное иммуногистохимическое исследование с использованием антитела к PA показало бóльшее разнообразие форм тел PA+-нейронов и характера ветвления их отростков, что может быть основанием для выделения дополнительных подтипов в зависимости от морфологических характеристик этих нейронов. Результаты проведенного нами морфометрического исследования показали, что по площади тел PA+-нейроны можно разделить на мелкие (до 60 мкм2), средние (до 150 мкм2) и крупные (до 360 мкм2). Неоднородность выявленных морфологических признаков может быть связана с различным функциональным назначением PA+интернейронов, а также с дифференциальной экспрессией генов между дорсальной и медиальной частями ганглионарного бугорка, из которых в процессе онтогенеза развиваются различные субпопуляции исследуемых нейронов [15]. При морфометрическом исследовании PA+нейронов в различных слоях соматосенсорной зоны коры SI было обнаружено, что в I слое их доля была наименьшей, в литературе сведения о наличии или отсутствии PA+-нейронов в этом слое довольно противоречивы [3, 10]. По нашим данным, PA+-нейроны I молекулярного слоя по своим размерам сопоставимы с PA+нейронами наружного зернистого (II) слоя и при подсчете могут быть отнесены к нему ошибочно. Количество PA+-нейронов, по нашим данным, имеет слабо выраженную тенденцию к увеличению от супрагранулярных - II-III к инфрагранулярным - V-VI слоям. Наибольшее количество PA+-нейронов локализовано в IV слое коры, в зоне формирования модульных группировок баррелей. При исследовании тангенциальных срезов нами было показано, что наибольшее количество PA+нейронов располагаются в септах баррелей (43%), при этом наиболее плотно они расположены в стенках барреля, благодаря чему можно видеть четкие контуры баррелей IV слоя. Преобладание количества PA+-нейронов в септальной области может быть связано с направлением хода дендритов PA+-нейронов во внутренней части барреля и формированием дендро-дендритных щелевых контактов, что, предположительно, может являться морфологической основой индивидуального локального пейсмейкерного ритмогенеза в баррелях и колонках зоны коры SI [8]. Имеются данные, что возрастание гиперполяризации приводит к активации на мембранах тел и аксонов PA+-нейронов потенциалзависимых калиевых H-каналов, продуцирующих волны эндогенной пейсмейкерной активности и демонстрирующих высокую пороговую активацию и дезактивацию [9, 11, 12, 14]. Щелевые контакты, объединяющие сети тормозных PA+-нейронов, способствуют облегчению синхронизации осцилляторной активности пейсмейкерных калиевых каналов и проведению сигнала с минимальной синаптической задержкой [1]. Таким образом, в результате настоящей работы установлены закономерности количественного послойного распределения PA+-нейронов, что может определять их функциональную роль в организации внутриколончатой ритмической активности коры мозга. Обнаружено морфологическое разнообразие формы и размеров тел PA+-нейронов и характера ветвления их отростков в каждом слое, а также в колонках зоны SI, что способствует пониманию роли нейронов разного размера в структурно-функциональной организации колонок каждого слоя зоны SI. PA+нейроны выявлены во внутренней части, стенках и септах барреля с существенным преобладанием их в септах. Разнообразие интернейронов может являться структурной основой для выполнения PA+-нейронами таких функций, как регуляция нормальной активности нейронов, генерация осцилляторной активности нейронных сетей, буферизация кальция, регуляция синаптической пластичности, обеспечение нейропротекторной функции, а также баланса между возбуждением и торможением в соматической коре. Однако, несмотря на то, что по морфологическим характеристикам PA+-нейроны разделяются довольно четко, дальнейшее исследование дифференциальной экспрессии генов в них, по нашему мнению, будет способствовать созданию геномного классификатора, существенно дополняющего и уточняющего морфофункциональную классификацию интернейронов.

About the authors

A. G. Sukhov

Southern Federal University

Email: w701@krinc.ru
Laboratory of Experimental Neurobiology; D. I. Ivanovsky Academy of Biology and Biotechnology

Ye. Yu. Kirichenko

Southern Federal University

Email: kiriche.evgeniya@yandex.ru
Laboratory of Functional Neuromorphology and Electron Microscopy; D. I. Ivanovsky Academy of Biology and Biotechnology

L. A. Belichenko

Southern Federal University

Email: labelichenko@gmail.com
Laboratory of Functional Neuromorphology and Electron Microscopy; D. I. Ivanovsky Academy of Biology and Biotechnology

References

Supplementary files