METHOD OF SELECTIVE DEMONSTRATION OF PROLIFERATING CELLS IN THE STRUCTURES OF DEVELOPING NERVOUS SYSTEM BASED ON THE DETECTION OF PHOSPHORYLATED H3 HISTONE

Full Text

Изучение развития нервной системы невозможно без определения пролиферативной активности клеток эмбриональных закладок, которые, обладая способностью делиться, мигрировать и дифференцироваться в различных направлениях в пределах единого нейрального зачатка, служат источником развития всех типов нервных клеток и клеток макроглии. В настоящее время исследователям доступны разнообразные методы выявления пролиферирующих клеток in situ, среди которых отмечают и маркирование фосфорилированного гистона H3 (ФГН3) [4]. Гистоны представляют собой небольшие основные ядерные белки с консервативной для всех эукариот структурой, обеспечивающие сборку нитей ДНК в хромосомы. Известно 5 различных типов гистонов [9]. Фосфорилирование гистона Н3 — необходимый этап подготовки к компактизации хроматина и спирализации ДНК, характерной для метафазных хромосом. Дефосфорилирование этого гистона происходит в конце митоза и сопровождается деконденсацией хромосом [12]. Существуют данные о том, что в нервных клетках фосфорилирование гистона Н3 не связано с пролиферацией. В частности, в нейронах зубчатой извилины гиппокампа фосфорилирование гистона Н3 происходит в процессе ответной реакции на стрессорное воздействие [10]. Однако остается неясным, приводит ли это фосфорилирование к компактизации хроматина, наблюдаемой при гиперхроматозе и «простом сморщивании» нервных клеток [3]. Несмотря на широкое использование ФГH3 в качестве пролиферативного маркера в онкологии [1, 3, 8], отсутствует систематизированная информация об оптимальных режимах фиксации материала, демаскирования и дальнейшей обработки срезов, а также о допустимых вариантах докраски препаратов, в которых пролиферирующие клетки выявляются при помощи реакции на гистон H3. Кроме того, остаётся не ясным, насколько удобно использовать этот маркер при анализе пролиферативной активности клеток формирующейся нервной системы. Цель настоящего исследования состояла в разработке простых и хорошо воспроизводимых способов иммуноцитохимического выявления ФГН3, пригодных для идентификации пролиферирующих клеток при обычной световой и конфокальной лазерной микроскопии. Для изучения возможности выявления делящихся клеток при помощи реакции на ФГН3 были использованы срезы эмбрионов крысы 13–20 сут внутриутробного развития и срезы головного мозга новорожденных крысят. Материал был фиксирован в цинк – формалине, спирт – формалине и цинк – этанол – формальдегиде [6]. Объекты исследования были залиты в парафин — Histomix (БиоВитрум, Россия). Срезы толщиной 5 и 12 мкм готовили на ротационном микротоме Leica RM 2125RT (Leica, Германия) и наклеивали на предметные стекла, покрытые специальным адгезивом [7]. Для выявления ФГН3 применяли поликлональные кроличьи антитела (ab5176, Abcam, Великобритания) и вторичные реагенты — Poly HRP Reagent из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection System QD430XAK (BioGenex, США), HRP Conjugate из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System SPD-015 (Spring Bioscience, США) и антикроличьи антитела, конъюгированные с флюорохромом TRITC (Dako, Дания). Для выявления продукта реакции на светооптическом уровне использовали хромоген 3`3-диаминобензидин из наборов DAB+ (Dako, Дания) и DAB 2-component (Spring Bioscience, США). На основании отработки различных режимов инкубации, дополнительных блокировок и проверки необходимости процедуры теплового демаскирования антигена, были выбраны два варианта протокола обработки препаратов — для обычной световой и для флюоресцентной (лазерной конфокальной) микроскопии. Сравнение результатов обработки препаратов, фиксированных различным образом, показало, что фиксация в цинк— этанол—формальдегиде лучше сохраняет иммунореактивность изучаемого антигена. Для световой микроскопии рекомендуется использовать следующий протокол окраски препаратов. 1. Удалить парафин и регидратировать срезы обычным способом. 2. После кратковременной (2–5 мин) промывки в дистиллированной воде перенести предметные стекла в 3% перекись водорода на 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы. 3. Смыть перекись дистиллированной водой и поместить стекла в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) рН 7,4 на 5–10 мин. 4. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество блокировочного раствора (Protein block DPB-125, Spring Bioscience, США или 5% раствор бычьего сывороточного альбумина) и оставить при комнатной температуре на 10 мин. Чтобы реагенты при инкубации не растекались по предметному стеклу и срезы не высыхали, рекомендуется нарисовать специальным фломастером (Liquid Blocker, PAP Pen, Dako Pen) вокруг срезов гидрофобный круг. 1. Аккуратно удалить блокировочный раствор и, не промывая препараты, нанести на срезы антитела к ФГН3, разведенные разбавителем для антител S0809 (Dako, Дания) до 1:200. Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 40 °С в течение 80 мин. 2. Смыть антитела и оставить препараты в ФСБ на 5–10 мин. 3. Удалить излишки ФСБ (промокнув стекло фильтровальной бумагой вокруг срезов), нанести необходимое количество реагента Poly HRP Reagent из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection System или HRP Conjugate из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System. Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 27 °С в течение 30 мин. 4. Смыть реагент и оставить препараты в ФСБ на 5–10 мин 5. Удалить излишки ФСБ (промокнув стекло фильтровальной бумагой вокруг срезов), нанести необходимое количество рабочего раствора DAB. В течение 1–5 мин происходит образование продукта гистохимической реакции. Этот процесс желательно контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления окрашенного фона. 6. Смыть раствор хромогена в 2–3 порциях дистиллированной воды (10–15 мин). 7. При необходимости докрасить цитоплазму клеток астровым синим (0,1% водный раствор). 8. Обезводить, просветлить и заключить препараты в перманентную среду (DPX, полистирол, канадский бальзам) обычным способом. В результате обработки препаратов отчетливо выявляются клетки (рис. 1), проходящие различные фазы митотического деления. При этом в формирующихся структурах мозга у эмбрионов 13–15 сут развития иммунопозитивные клетки обнаруживаются преимущественно в так называемой «зоне М» [2] — слое клеток на границе с вентрикулярной поверхностью, тогда как в «зоне S», в которой клетки проходят синтетический период клеточного цикла, иммунопозитивные клетки встречаются редко. На более поздних стадиях пренатального развития отчетливо определяется вторая пролиферативная зона закладки неокортекса — промежуточная. Докрашивание препаратов астровым синим, как и в случае с ядерным антигеном пролиферирующих клеток [5], улучшает ориентацию в структурах препарата, не маскируя продукта иммуноцитохимической реакции (см. рис. 1). Для конфокальной микроскопии рекомендуется использовать следующий протокол окраски препаратов. 1. Удалить парафин и регидратировать срезы обычным способом. 2. Поместить предметные стекла в 0,01 М ФСБ рН 7,4 на 5–10 мин. 3. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество блокировочного раствора — (Protein block) (DPB-125 — Spring Bioscience, США) или 5% раствор бычьего сывороточного альбумина и оставить при комнатной температуре на 10 мин. Чтобы реагенты при инкубации не растекались по предметному стеклу и срезы не высыхали, рекомендуется нарисовать специальным фломастером (Liquid Blocker, PAP Pen, Dako Pen) вокруг срезов гидрофобный круг. 4. Аккуратно удалить блокировочный раствор и, не промывая препараты, нанести на срезы антитела к ФГН3, разведенные разбавителем для антител до 1:400. Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 40 °С в течение 20 ч. 5. Смыть антитела и оставить препараты в ФСБ на 5–10 мин. 6. Удалить излишки ФСБ (промокнув фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов), нанести необходимое количество вторичных антител, конъюгированных с TRITC (1:25, R0156, Dako). Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 40 °С в течение 30 мин. 7. Смыть реагент и оставить препараты в ФСБ на 5–10 мин. 8. Промыть срезы в дистиллированной воде (10–15 мин) и заключить в специальную водную нефлюоресцирующую среду Mounting Medium (Dako, Дания). Перед заключением препаратов можно добавить этап докраски ядер клеток флюоресцентным красителем (например, Hoechst 33342 или SYTOX-green), после чего необходима дополнительная промывка в дистиллированной воде (10–20 мин). В результате обработки препаратов флюоресцируют только хромосомы митотически делящихся клеток. Данный протокол может быть использован не только для селективного выявления пролиферирующих клеток, но и как составная часть более сложных методов [1], для одновременного выявления ФГН3 в комбинации с другими цитохимическими маркерами (рис. 2). При использовании представленных двух вариантов протоколов могут быть получены высококонтрастные цифровые изображения препаратов при малом увеличении, легко поддающиеся бинаризации и автоматическому подсчету фигур митоза с использованием компьютерной программы ImageJ (NIH, США) и аналогичных. Это позволяет очень быстро (в сравнении с ручным способом) определять число делящихся клеток на единице площади препарата и проводить статистическую обработку полученных данных. Поскольку на изготовленных препаратах отсутствуют признаки неспецифического окрашивания, а также не имеется тенденции к накоплению продукта реакции в зонах созревания нейронов (кортикальной пластинке и др.), можно заключить, что представленные протоколы выявления ФГН3 пригодны для изучения пролиферации клеток развивающегося мозга. Тем не менее, учитывая данные о возможности фосфорилирования гистона Н3 при стрессе [9], следует с осторожностью использовать этот маркер при изучении нервной системы взрослых млекопитающих. Таким образом, представленные протоколы обработки позволяют с высокой селективностью и хорошей воспроизводимостью выявлять делящиеся клетки в структурах развивающегося головного мозга. В качестве оптимального фиксатора для ФГН3, позволяющего отказаться от теплового демаскирования при постановке иммуноцитохимической реакции, рекомендуется использовать цинк – этанол – формальдегид.

About the authors

D. E. Korzhevskiy

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru

O. V. Kirik

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

G. V. Beznin

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

References

Supplementary files