Morphological changes in the testicle in "Sertoli cell only" syndrome in men with non-obstructive azoospermia

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Потеря фертильности может иметь катастрофические последствия не только для пациента, но и для человечества в целом. В условиях демографического кризиса и старения населения многих стран сохранение фертильности мужского населения приобретает важное значение. В настоящее время 15% пар в мире страдают бесплодием [1]. Мужской фактор бесплодия встречается в 50% супружеских пар, которые обращаются за медицинской помощью с проблемой рождения ребенка [2, 3].

Азооспермия – отсутствие половых клеток в эякуляте, является наиболее тяжелой формой мужского бесплодия, с которой сталкивается около 10–15% бесплодных мужчин [4]. Если обструктивная форма азооспермии связана с нарушением транспорта сперматозоидов в уретру и в женские половые пути, и при этом сперматогенез у пациента может быть сохранен. То при секреторной азооспермии, доля которой составляет 60%, отсутствие половых клеток в сперме объясняется нарушением их образования. У 1/3 мужчин с секреторной (необструктивной азооспермией) причину патоспермии выявить не удается, что вынуждает специалистов констатировать идиопатическую форму мужского бесплодия [4].

В настоящее время, только азооспермия и тяжелая олигозооспермия (концентрация сперматозоидов <5 млн / мл), установленные на основании спермограммы, являются показанием для биопсии яичка. Биопсия яичка может носить и диагностическое (позволяет провести морфологическое исследование биоптатов яичка), и лечебное направление (позволяет получить тестикулярные сперматозоиды для выполнения программы вспомогательных репродуктивных технологий) [5].

          Синдром только клеток Сертоли (СТКС), один из наиболее распространенных морфологических типов секреторной азооспермии. Для СТКС характерно отсутствие клеток сперматогенеза в извитых семенных канальцах и наличие клеток Сертоли [6], что трактуется специалистами как тяжелые морфологические нарушения в яичке при азооспермии. СТКС встречается у 26,3–57,8% мужчин с азооспермией [7].

          Точный патогенез синдрома клеток Сертоли до конца не изучен. Известно, что генетические аномалии такие как синдром Клайнфельтера и микроделеции области AZF Y-хромосомы приводит к развитию СТКС [8, 9]. Некоторые авторы считают, что воздействие токсинов, радиоактивное излучение, травмы, вирусные инфекции могут способствовать гибели клеток сперматогенеза и появлению СТКС [10, 11, 12]. Следовательно морфологический анализ яичка и поиск причин развития СТКС является актуальным вопросом современной медицины.

          Цель. Оценить морфологические изменения в яичке при синдроме только клеток Сертоли.

          Материалы и методы. В исследование изначально были включены 19 мужчин в возрасте 27,2±4,2 лет, у которых по данным спермограммы была выявлена азооспермия. Критериями включения были: подтвержденный морфологически синдром только клеток Сертоли, отсутствие воспалительных явлений в органах мужской репродуктивной системы, отрицательные результаты биопсии яичка. Критерии исключения: генетические аномалии, тяжелая соматическая патология, метаболические нарушения. Таким образом, после морфологического исследования биоптатов яичка, критериям включения соответствовали 9(47,3%) человек, которые составили окончательную когорту исследования.

          Все пациенты были включены в программу репродуктивных технологий (ВРТ), для реализации которой была выполнена операция microTESE (микродиссекционное извлечение сперматозоидов из яичек). Биоптаты яичка подвергались фиксации в 10% растворе формалина. Далее влажные фиксированные биоптаты подвергались дегидратации спиртом. Морфологический анализ биоптатов проводился в научно-образовательном ресурсном центре инновационных технологий иммунофенотипирования, цифрового пространственного профилирования и ультраструктурного анализа Российского университета дружбы народов на световом микроскопе Olympus CX 43 (Япония). На гистологических срезах яичка, окрашенных гематоксилином и эозином, проводилась оригинальная морфологическая дифференцировка извитых семенных канальцев с СТКС по следующим признакам:

- Синдром только клеток Сертоли со зрелыми клетками Сертоли;

- Синдром только клеток Сертоли с признаками дистрофии клеток Сертоли;

- Синдром клеток Сертоли с признаками апоптоза клеток Сертоли.

Так же оценивались диаметр извитых семенных канальцев, толщина оболочки извитых семенных канальцев, производился подсчет клеток Сертоли.

Для дополнительной визуализации клеток интерстиция яичка использовалась окраска толуидиновый синий. Толуидиновый синий является основным метахроматическим красителем, который связывается с отрицательно заряженными компонентами клеток и тканей, такими как биогенные амины, содержащиеся в гранулах тучных клеток, окрашивая их в характерный темно-фиолетовый цвет. Данный вид окрашивания обеспечивает детекцию тучных клеток в интерстиции яичка, качественные и количественные характеристики которых оценивались в 1 мм².

Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом Российского университета дружбы народов (протокол №7 от 22.09.2016).

          Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 8.0. Описательная статистика данных проводилась с расчетом средних значений и среднеквадратичных отклонений М±σ. Для установления различий между парными признаками использовались непараметрические критерии Крускала-Уоллиса (Н), Манна-Уитни (U). Сила и направление связи признаков толщины оболочки извитого семенного канальца с количеством клеток Сертоли и тканевых базофилов определялись с помощью корреляционного анализа, где коэффициент корреляции (r) выражается как положительное или отрицательное число от -1 до 1. Математическое представление взаимосвязи между независимой и зависимой переменными выражалось с помощью уравнения линейной регрессии. Для оценки различий между показателями разных переменных применялся однофакторный дисперсионный анализ с использованием F-критерия для оценки равенства сравниваемых дисперсий. Различия между выборками считали значимыми, если значение F-критерия превышало критическое значение для уровня значимости дисперсий α=0,01 и уровня значимости различий средних значений р ≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Распределение извитых семенных канальцев в зависимости от качественных в них изменений с учетом морфологического типа клеток Сертоли представлено на рисунке 1. Почти в половине срезов извитых семенных канальцев у пациентов с СТКС клетки Сертоли имели неизмененное строение: форма- удлиненная, достаточно большое овальной формы ядро с ядрышком, цитоплазма содержит большое количество включений липидов, гликогена, кристаллоидов (рис. 2). Клетки Сертоли прилегали своим основанием к базальной мембране извитого семенного канальца, а их верхушка достигала просвет канальца. Клетки Сертоли имели многочисленные укороченные цитоплазматические отростки. Каждый третий извитой семенной каналец содержал клетки Сертоли с признаками дистрофии: уменьшение размеров ядра с признаками кариорексиса, появление множества вакуолей в цитоплазме. Почти каждый пятый извитой семенной каналец содержал клетки Сертоли с признаками апоптоза: изменение формы и очертания ядра, уменьшение объема цитоплазмы, отсутствие цитоплазматических отростков и сертоли-сертолиевых контактов.

          Рисунок 1. Распределение извитых семенных канальцев в зависимости от качественных изменений в них клеток Сертоли у пациентов с секреторной азооспермией.

Рисунок 2. Гистологический препарат яичка пациента с необструктивной азооспермией, синдром только клеток Сертоли. Окраска гематоксилин и эозин, увеличение х40.

Среднее количество клеток Сертоли в одном извитом семенном канальце было 15,4±6,1. Количество клеток Сертоли значимо отличалось в зависимости от качественных изменений в извитых семенных канальцах (рис. 3).

Рисунок 3. Среднее количество клеток Сертоли в одном извитом семенном канальце в зависимости от качественных изменений в нем.

Морфометрия размера извитых семенных канальцев показала, что диаметр канальцев, где были зрелые клетки Сертоли был 44,7±3,6 мкм, где были клетки Сертоли с признаками дистрофии – 35,2±3,1 мкм, где были сустентоциты с признаками апоптоза – 21,8±2,7 мкм (р<0,05).

Толщина оболочки извитого семенного канальца при СТКС была в среднем 0,63±0,18 мкм. В канальцах, где были зрелые клетки Сертоли, их толщина составила 0,57±0,03 мкм, где были клетки Сертоли с признаками дистрофии – 0,64±0,02 мкм, где были сустентоциты с признаками инволюции – 0,69±0,02 мкм (р>0,05). Расчет корреляции между толщиной оболочки извитого семенного канальца и количеством клеток Сертоли показал сильную и обратную связь между этими признаками (r=-0,87). Однофакторный дисперсный анализ показал, что fкр(0,05; 1; 52) = 4,00, что подтверждает существенное влияние толщины оболочки на количество клеток Сертоли, что отражается на качестве сперматогенеза. Уравнение линейной регрессии показало, что утолщение оболочки извитого семенного канальца на 0,0068 мкм, что влечет за собой ухудшение проницаемости гематотестикулярного барьера, и будет способствовать гибели одной клетки Сертоли.

Окрашивание срезов биоптатов яичка толуидиновым синим показало, что чем более выраженные дегенеративные изменения в клетках Сертоли, тем большее количество тучных клеток в интерстиции яичка (рис. 4). У мужчин с необструктивной азооспермией, с СТКС тучные клетки локализовались в основном в интерстиции яичка, перитубулярно (рис. 5). Количество тучных клеток в 1 мм² интерстиция яичка в среднем было 8,5±0,3, однако значимой разницы количества тучных клеток от степени выраженности дегенерации клеток Сертоли получено не было (р>0,05).

Расчет корреляции между толщиной оболочки извитого семенного канальца и количеством тучных клеток в интерстиции яичка показал сильную и прямую связь между этими признаками (r=0,83). Однофакторный дисперсный анализ показал, что fкр(0,05; 1; 52) = 4,00, что подтверждает существенное влияние количества тучных клеток на толщину оболочки извитого семенного канальца. Уравнение линейной регрессии показало, что при увеличении количества тучных клеток в интерстиции яичка на 1 единицу будет приводить к утолщению оболочки извитого семенного канальца на 0,17 мкм.

Рисунок 4. Количество тучных клеток в зависимости от дегенеративных изменений в клетках Сертоли.

Рисунок 5. Гистологический препарат яичка при необструктивной азооспермии, синдром только клеток Сертоли. Окраска толуидиновым синим: а - СТКС со зрелыми клетками Сертоли; b – СТКС с признаками дистрофии, с – СТКС с признаками апоптоза. Черная стрелка указывает на тучную клетку расположенную в интерстиции яичка; зеленая стрелка указывает на тучную клетку, расположенную перитубулярно; красная стрелка указывает на клетки Сертоли; звездочка указывает на просвет извитого семенного канальца

ОБСУЖДЕНИЕ

У млекопитающих развитие половых клеток осуществляется под влиянием двух видов соматических клеток: Лейдига и Сертоли. Клетки Сертоли в репродуктивной системе у мужчин выполняют множество важных функций. Они играют важную роль в правильном росте и развитии сперматогониев, секретируя вещества, необходимые для их роста и питания. Клетки Сертоли также секретируют антимюллеров гормон, который приводит к регрессии мюллеровых протоков у плода мужского пола. Клетки Сертоли также секретируют ингибин-В, который оказывает подавляющее действие на секрецию ФСГ в гипофизе. В свою очередь, активин, секретируемый клетками Сертоли, обеспечивает положительную обратную связь с гипоталамо-гипофизарной системой стимулируя выработку ФСГ [13, 14, 15].

          По данным Ghanami Gashti N. и соавт. у пациентов с СТКС извитые семенные канальцы яичка как правило небольшого диаметра, наблюдается гиалинизация и утолщение оболочки канальцев с перитубулярным фиброзом, а также неравномерное утолщение внутреннего слоя коллагена [6]. Утолщенная оболочка извитых семенных канальцев может ухудшить гормональную регуляцию клеток Сертоли, что может повлиять на уровни ингибина B, ФСГ и сперматогенез [16]. Данное исследование показало, что на фоне дегенеративных изменений в извитых семенных канальцах и гибели сперматогенного эпителия количество клеток Сертоли уменьшается. Была выявлена обратная и сильная связь между толщиной оболочки извитого семенного канальца и количеством клеток Сертоли (r=-0,87), что косвенно свидетельствует о нарушении проницаемости гематотестикулярного барьера, что приводит не только к гибели клеток сперматогенеза, но и дистрофии сустентоцитов.

          Роль микроокружения извитых семенных канальцев до конца не изучена. Однако все специалисты понимают, что присутствие тех или иных популяций клеток в интерстиции яичка, помимо клеток Лейдига и фибробластов, могут оказывать существенное влияние на морфологию и функцию яичка. В последнее время в литературе появились сообщения о присутствии тучных клеток в интерстиции яичка. Тучные клетки представляют собой мононуклеарные гранулированные клетки иммунной системы, имеющие овальную или неправильную форму. Известно, что гранулы тучных клеток содержат гистамин, гепарин, химазу, триптазу, катепсин G, карбоксипептидазу А и фактор некроза опухоли-альфа (TNFα) [17]. Активация тучных клеток происходит в ответ на стимуляцию аутореактивных Т-клеток, иммуноглобулина Е, комплемента, цитокинов, нейропептидов [18]. Тучные клетки помогают обеспечить гомеостаз яичку, благодаря регуляции сосудистой проницаемости и иммуномодуляции. Так же известна фиброгенная активность тучных клеток при патологических состояниях, за счет повышенной секреции триптазы, химазы, гистамина, TGF-β1, IL-13, IL-9, гликозаминогликана FGF-2 [19]. Abdel-Hamid A.A.M. и соавт. выявили значительную отрицательную корреляцию между количеством тучных клеток и индексом пролиферации (Ki67) при тяжелых нарушениях сперматогенеза и синдроме только клеток Сертоли в том числе [20]. В данном исследовании была выявлена сильная и прямая зависимость между толщиной оболочки извитого семенного канальца и количеством тучных клеток в интерстиции яичка (r=0,83), что убедительно демонстрирует участие тучных клеток в повреждении гематотестикулярного барьера, и, следовательно, в нарушении функции сперматогенного эпителия.

Значимых различий между количеством тучных клеток в интерстиции яичка и количеством клеток Сертоли в семенных канальцах в этом исследовании получено не было. Возможно, это было связано с очень узкой выборкой пациентов, или с выбором менее специфичной детекции тучных клеток. Однако, полученные результаты отчетливо демонстрируют перспективу дальнейших морфологических исследований яичка с иммуногистохимическим окрашиванием тучных клеток, которые позволят получить больше информации в плане их участия в патогенезе синдрома только клеток Сертоли.

          ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синдром только клеток Сертоли встречается у 47,3% пациентов с необструктивной азооспермией. При синдроме только клеток Сертоли в почти половине извитых семенных канальцев присутствуют зрелые сустентоциты. Чем толще оболочка извитого семенного канальца, тем меньше клеток Сертоли (r=-0,87) и более выраженные процессы дистрофии в них. Данное исследование показало, что толщина извитого семенного канальца напрямую связана с количеством тучных клеток в интерстиции яичка (r=0,83), что демонстрирует патологическое влияние этих клеток на архитектонику гематотестикулярного барьера и косвенно на сперматогенез. Поэтому изучение клеточного компонента интерстиция яичка и микроокружения извитых семенных канальцев имеет важное и решающее значение для понимания сложных регуляторных процессов сперматогенеза.

Окрашивание тучных клеток толуидиновым синим является широко используемым методом в гистологии и патологии для их идентификации и количественного определения в различных тканях. Изучение распределения, морфологии и плотности тучных клеток в интерстиции яичка может быть полезным для понимания их роли в развитии тяжелых форм нарушения сперматогенеза.

About the authors

Nina Kulchenko

Author for correspondence.
Email: kle-kni@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4468-3670
SPIN-code: 1899-7871

Cand. Sci. (Med.)

References

Supplementary files