Evaluation of the level expression of the Russian clone of PD-L1 antibodies and comparison with validated clones from other manufacturers on stomach cancer material

Full Text

Введение

Рак желудка (РЖ) является пятым по распространенности и третьим по уровню летальности онкологическим заболеванием в мире [1]. В Российской Федерации, по данным официальной статистики за последние годы распространенность РЖ составляет в среднем 93–95 случаев на 100 тысяч населения [2, 3]. Несмотря на то, что показатель заболеваемости к 2018 г. снизился на 12.62% по сравнению с 2008 г. (25,16 и 28,61 случаев на 100 тысяч населения соответственно), абсолютное число новых случаев составляет порядка 35–40 тысяч в год. Значительное число случаев рака желудка диагностируется на поздних стадиях, летальность в течение первого года после установления диагноза приближается к 50% [4].

Прогноз при распространенных и метастатических формах РЖ остается неблагоприятным – медиана выживаемости колеблется в пределах нескольких месяцев [5]. Появление иммунотерапии злокачественных опухолей с применением ингибиторов контрольных точек иммунитета стало революционным открытием в последнее десятилетие. Одним из наиболее изученных рецепторов ≪контрольных точек≫ является белок программируемой клеточной смерти 1 (PD1 – programmed cell death protein 1, CD279) и его лиганды. Для клинического использования были одобрены анти-PD1 антитела (ниволумаб, Nivolumab; пембролизумаб, Pembrolizumab) [6]. Показано, что эти препараты оказывают иммуностимулирующее действие, увеличивают количество опухолеспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов. Для каждого из этих препаратов предусмотрены собственные диагностические системы [7], однако далеко не всегда диагностические возможности лабораторий на местах позволяют определять экспрессию PD-L1 с помощью того диагностического набора, который прописан в инструкции к химиопрепарату. Исследования по сопоставлению экспрессии различных клонов антител для PD-L1 при раке желудка немногочисленны. Более того, с целью обеспечения технологического суверинитета Российской Федерации в сфере медицинских технологий, необходимо проведение исследований с отечественным клоном антител к PD-L1 и сравнение результатов с уже валидированными аналогами. В 2021 году группой исследователей в Российской Федерации разработан собственный клон антител к PD-L1 (PBM-1A4), таким образом, имеется существенная необходимость в сопоставлении между собой различных тест-систем для выявления PD-L1-позитивных опухолей желудка. Также необходимо проследить связь экспрессии клона антител PBM-1A4 с клинико-морфологическими и прогностическими характеристиками рака желудка.

Целью данной работы является оценка экспрессии отечественного клона антител к PD-L1 (PBM-1A4), определение ее связи с клинико-морфологическими и параметрами рака желудка, сопоставление экспрессии различных клонов PD-L1 при раке желудка (SP142, SP263, 22С3 и PBM-1A4). 

Материалы и методы

В исследовании использованы образцы операционного материала от 131 пациента с диагнозом рака желудка. Пациенты не получали до операции химио- или лучевую терапию. Критерии исключения: карцинома in situ, малый объем материала в парафиновых блоках, наличие нейроэндокринного рака, лимфомы желудка или гастроинтестинальной стромальной опухоли желудка. Возраст пациентов варьировал от 22 до 82 лет (медиана - 62 года). Медиана наблюдения за пациентами составила 81 мес.

Архивные стекла изучали при помощи светового микроскопа DM2500 (Leica Microsystems, Germany).

Каждый образец окрашивали иммуногистохимическим методом с антителами к ингибитору контрольных точек иммунитета PD-L1 (4 клона различных производителей, см. таблицу 1).

Таблица 1. Характеристики использованных антител

Для определения экспрессии PD-L1 с использованием клонов антител SP142 и SP263 (Roche Ventana, США) использовали систему детекции OptiView DAB IHC Detection Kit. На приборе Ventana BenchMark Ultra (Roche Ventana, США) по стандартному протоколу не позднее чем через 24 часа после изготовления парафиновых срезов. В качестве контроля использованы ткани миндалины и плаценты. Для оценки отечественных антител к PD-L1 использовали антитела клона PBM-1A4 («ПраймБиоМед», Россия) в разведении 1:50. Инкубацию проводили в течение 32 минут. Для оценки экспрессии PD-L1 клона 22C3 использовали мышиное моноклональное первичное антитело против PD-L1. Окрашивание выполняли на автостейнере Dako Autostainer Link 48 в сочетании с системой детекции EnVision DAB (Agilent Technologies, США).

Результаты реакций оценивали с помощью светового микроскопа DM2500 (Leica Microsystems, Германия) двумя независимыми исследователями. Для получения микрофотографий использовали сканер PANNORAMIC 250 Flash III (3DHISTECH, Hungary).

Критерием для позитивного PD-L1 статуса опухоли выбрано полное или частичное мембранное окрашивание не менее 1 опухолевой и иммунной клетки на 100 клеток, расположенных в толще опухоли или не далее 1 мм от границы опухоли. В подсчет включали как опухолевые, так и иммунные клетки (использовался показатель CPS, Combined Positive/positivity Score [8]). Допускалось наличие гранулярного или зернистого окрашивания по ходу мембраны клетки. Долю окрашенных клеток подсчитывали отдельно для каждого из полей зрения и выводили среднее значение для всего препарата. Для удобства сравнения результаты оценки реакции отображали в баллах: 0 – полное отсутствие реакции, 1 - CPS 1 или менее, 2 - CPS >1<10, 3 - CPS>10, 4 - CPS >50.

Результаты оценки экспрессии маркеров сопоставлены между собой и с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка (возраст, пол, локализация опухоли, макроскопический тип по R.Bormann, гистологический тип по классификации ВОЗ 2019 г, гистологический тип по классификации P. Lauren, клиническая стадия, глубина инвазии (Т), количество метастазов в лимфатические узлы (N), наличие/отсутствие отдаленных метастазов (М)) и другими.

Статистические методы

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы PASW Statistics 22 и MedCalc версии 20.021. Описательные статистики представлялись в виде среднего и стандартного отклонения, медианы и 25-го и 75-го процентилей, минимального и максимального значений в выборке для количественных переменных, а также частот встречаемости и долей в выборке для качественных переменных.

Для сравнения номинальных переменных в двух несвязанных совокупностях использовался критерий Хи-квадрат, а при наличии ограничений для его использования – точный критерий Фишера. Для оценки согласованности результатов окрашивания клонов PD-L1 попарно использовалась каппа-статистика Коэна, а также построены графики Бланда—Альтмана. Результаты оценки согласия методов с применением каппы Коэна (k) представлены в виде диапазона значений от минимального до максимального (min k – max k), а также среднего значения (μ). Коэффициенты согласия (каппа Коэна) расценивались следующим образом: слабый (k > 0–0,2), незначимый (k > 0,21–0,4), умеренный (k > 0,41–0,6), существенный (k > 0,61–0,8) и полное согласие (k > 0,81–1,0). Анализ Бланда-Альтмана выполнен с оценкой средней разницы попарно всех методов и границы согласованности (±1,96 среднеквадратичного отклонения средней разницы), его 95% доверительный интервал (95% ДИ). Рассчитана положительная и отрицательная согласованность для каждой пары данных (методов окрашивания) с помощью таблиц сопряженности.

Уровень значимости (p) в целом не превышал 0.050 во всех вышеописанных сравнениях. Для множественных сравнений в трех группах исследования использовалась поправка Бонферони, уровень значимости р принимался равным 0.050/3=0.017.

Результаты исследования

Экспрессия клона антител PBM-1A4 к PD-L1 и ее взаимосвязь с клинико-морфологическими параметрами рака желудка

Исследовано 39 образцов операционного материала рака желудка. Положительный PD-L1-статус с маркером PBM-1A4 (значение CPS равно 2, 3 или 4) выявлен в 18 наблюдениях из 39 (46,2%), негативный PD-L1-статус (значение CPS равно 0 или 1) - в 21 случае (53,8%). 

Положительная экспрессия маркера выявлялась как в клетках инфильтрата, так и в клетках опухоли. Среди 18 наблюдений с положительным PD-L1-статусом выявлено 7 случаев с экспрессией более чем в 1%, но менее чем в 10% (CPS 2 балла); 8 случаев с экспрессией более чем в 10%, но менее чем в 50% (CPS 3 балла) и 3 случая с экспрессией более чем в 50% клеток (CPS 4 балла). Экспрессия PD-L1 (PBM-1A4) представлена на рисунках 1-2, описательная статистика – в таблице 2.

Таблица 2. Описательная статистика клинико-морфологических характеристик выборки пациентов c положительным PD-L1-статусом (PBM-1A4) в опухоли и негативным PD-L1-статусом (PBM-1A4) в опухоли.

Результаты статистического анализа полученных данных представлены в таблице 3 (для качественных данных) и таблице 4 (для количественных данных).

Значимые различия между PD-L1(PBM-1A4)-позитивными и PD-L1(PBM-1A4)-негативными опухолями обнаружены при сопоставлении макроскопических типов по R.Bormann (рис. 3а). Второй (блюдцеобразный) макроскопический тип встречался среди PD-L1(PBM-1A4)-позитивных опухолей значимо чаще, чем среди PD-L1(PBM-1A4)-негативных опухолей (61,1% против 23,8%). При статистическом анализе уровень значимости составил р=0,011. Также выявлены значимые различия по гистологическому типу опухолей (рис. 3б). Среди PD-L1(PBM-1A4)-позитивных новообразований тубулярный гистологический тип выявлен в 83,3% наблюдений, а среди PD-L1(PBM-1A4)-негативных опухолей в 47,6% случаев. При статистическом анализе уровень значимости составил р=0,042.

По другим клинико-морфологическим параметрам различий между группами не обнаружено. В частности, количество мужчин среди PD-L1 (PBM-1A4)-позитивных опухолей составляет 61,1%, среди PD-L1 (PBM-1A4)-негативных опухолей – 66,7% (р=0,718) (рис. 3в), средний возраст пациентов в группе PD-L1(PBM-1A4)-позитивных опухолей составил 62 год, медиана 63 года; в группе PD-L1(PBM-1A4)-негативных опухолей средний возраст 61 года, медиана 63 года, (р=0,922). Количество опухолей проксимальной и дистальной локализации среди PD-L1(PBM-1A4)-позитивных образований составило 50% и 33,3% соответственно, а среди PD-L1(PBM-1A4)-негативных опухолей 57,1% и 33,3% соответственно (р=0,788) (рис. 3г). Средний размер PD-L1(PBM-1A4)-позитивных опухолей составил 7,1 см, PD-L1(PBM-1A4)-негативных 6,8 см (р=0,707). Количество пациентов с опухолями HG среди PD-L1(PBM-1A4)-позитивных новообразований составило 66,7%, а среди PD-L1(PBM-1A4)-негативных – 61,5% (р=0,778). Не обнаружено различий и по наличию эмболов в кровеносных сосудах (р=0,768), глубине инвазии (р=0,834), количеству лимфатических узлов с метастазами (р=0,212), наличию отдаленных метастазов (р=0,442), клинической стадии (р=0,905) и подтипу по P.Lauren (р=0,199).

Таким образом, PD-L1(PBM-1A4)-позитивные опухоли чаще относятся ко второму макроскопическому типу по R.Bormann (р=0,011), среди них преобладают тубулярные аденокарциномы (р=0,042).

Таблица 3. Результаты статистического анализа экспрессии PD-L1 (PBM-1A4) для качественных клинико-морфологических характеристик.

Таблица 4. Результаты статистического анализа экспрессии PD-L1 (PBM-1A4) для количественных клинико-морфологических характеристик.

Сопоставление экспрессии различных клонов PD-L1 при раке желудка

Экспрессия отечественного клона антител к PD-L1 (PBM 1A4) была сопоставлена с уже ранее валидированными клонами антител: SP263 (Roche, Ventana), SP142 (Roche, Ventana) и 22С3 (Dako). Для сравнения использованы 39 наблюдений рака желудка, окрашенные одновременно всеми клонами антител.

При сопоставлении с клоном SP263 выявлено, что из 24 наблюдений положительных при окрашивании SP263 только 16 (66,7%) были положительными при окрашивании PBM 1A4 (таблица 7). Общее процентное соответствие (точность)

метода с использованием клона PBM 1A4 составило 60% по отношению к клону SP263 (таблица 8), чувствительность 20%, специфичность 86,67%, положительная прогностичеcкая ценность (PPV) 50%, отрицательная прогностическая ценность (NPV) 61,9%. Различная экспрессия маркеров на примере одного случая тубулярной аденокарциномы желудка приведена на рисунке 4.

Таблица 7. Комбинационная таблица PD-L1 SP263 (CPS) и PD-L1 PBM 1A4 (CPS)

Таблица 8. Статистические показатели совпадения экспрессии PD-L1, выявленные клонами антител PD-L1 SP263 (CPS) и PD-L1 PBM 1A4 (CPS)

Показатель согласованности (каппа Коэна) результатов диагностики оказался равен 0,496 (95% ДИ 0,23887 до 0,75338, Стандартная ошибка 0,13125), что может трактоваться как умеренная согласованность.

Коэффициент корреляции Пирсона между экспрессией PD-L1, выявленной клонами SP263 и PBM 1A4 составил 0,376 (95% ДИ 0,231-0,443, р=0,361) (рисунок 5а).

Анализ Бланда-Альтмана выполнен, для визуализации средней разницы в CPS между клонами PD-L1 SP263 и PD-L1 PBM 1A4 и средней экспрессии PD-L1, выявленной двумя клонами (таблица 9, рисунок 5б). Анализ графика Бланда-Альтмана определил среднюю разницу в -0.38% между экспрессией PD-L1, выявленной клонами PD-L1 SP263 и PD-L1 PBM 1A4, во всех образцах (нижние 2,5-й и верхний 97,5-й процентили различий составляли -1,92% и 1,15% соответственно).

Таблица 9. Статистические параметры анализа Бланда-Альтмана

При сопоставлении с клоном SP142 выявлено, что из 13 наблюдений положительных при окрашивании SP142 12 (92,3%) были положительными при окрашивании PBM 1A4 (таблица 10). Общее процентное соответствие (точность) метода с использованием клона PBM 1A4 составило 84,21% по отношению к клону SP142 (таблица 11), чувствительность 92,31%, специфичность 80,00%, положительная прогностичеcкая ценность (PPV) 70,59%, отрицательная прогностическая ценность (NPV) 95,24%.

Таблица 10. Комбинационная таблица PD-L1 SP142 (CPS) и PD-L1 PBM 1A4 (CPS)

Таблица 11. Статистические показатели совпадения экспрессии PD-L1, выявленные клонами антител PD-L1 SP142 (CPS) и PD-L1 PBM 1A4 (CPS)

Показатель согласованности (каппа Коэна) результатов диагностики оказался равен 0,67335 (95% ДИ 0,43954 до 0,90716, Стандартная ошибка 0,11929), что может трактоваться как существенная согласованность.

Коэффициент корреляции Пирсона между экспрессией PD-L1, выявленной клонами SP142 и PBM 1A4 составил 0,581 (95% ДИ 0,501-0,676, р=0,123) (рисунок 5в).

Анализ Бланда-Альтмана выполнен, для визуализации средней разницы в CPS между клонами PD-L1 SP142 и PD-L1 PBM 1A4 и средней экспрессии PD-L1, выявленной двумя клонами (таблица 12, рисунок 5г). Анализ графика Бланда-Альтмана определил среднюю разницу в 0,237% между экспрессией PD-L1, выявленной клонами PD-L1 SP142 и PD-L1 PBM 1A4, во всех образцах (нижние 2,5-й и верхний 97,5-й процентили различий составляли -1,81% и 2,3% соответственно).

Таблица 12. Статистические параметры анализа Бланда-Альтмана

При сопоставлении с клоном 22С3 выявлено, что из 18 наблюдений положительных при окрашивании 22С3 лишь 6 (30%) были положительными при окрашивании PBM 1A4 (таблица 13). Общее процентное соответствие (точность) метода с использованием клона PBM 1A4 составило 56,41% по отношению к клону 22С3 (таблица 14), чувствительность 54,55%, специфичность 57,14%, положительная прогностичеcкая ценность (PPV) 33,33%, отрицательная прогностическая ценность (NPV) 76,19%.

Таблица 13. Комбинационная таблица PD-L1 22С3 (CPS) и PD-L1 PBM 1A4 (CPS)

Таблица 14. Статистические показатели совпадения экспрессии PD-L1, выявленные клонами антител PD-L1 22С3 (CPS) и PD-L1 PBM 1A4 (CPS)

Показатель согласованности (каппа Коэна) результатов диагностики оказался равен 0,097959 (95% ДИ -0,19401 до 0,38993, Стандартная ошибка 0,14896), что может трактоваться как отсутствие согласованности.

Коэффициент корреляции Пирсона между экспрессией PD-L1, выявленной клонами SP142 и PBM 1A4 составил 0,192 (95% ДИ 0,001-0,236, р=0,973) (рисунок 5д).

Анализ Бланда-Альтмана выполнен, для визуализации средней разницы в CPS между клонами PD-L1 22С3 и PD-L1 PBM 1A4 и средней экспрессии PD-L1, выявленной двумя клонами (таблица 15, рисунок 5е). Анализ графика Бланда-Альтмана определил среднюю разницу в 0,667% между экспрессией PD-L1, выявленной клонами PD-L1 22С3 и PD-L1 PBM 1A4, во всех образцах (нижние 2,5-й и верхний 97,5-й процентили различий составляли -3,52% и 2,19% соответственно).

Таблица 15. Статистические параметры анализа Бланда-Альтмана

Таким образом, из всех валидированных ранее методик наибольшую согласованность с экспрессией PBM 1A4 демонстрирует клон SP142 (Roche, Ventana). Показатель согласованности (каппа Коэна) результатов диагностики оказался равен 0,67335 (95% ДИ 0,43954 до 0,90716, стандартная ошибка 0,11929), что может трактоваться как существенная согласованность. При сопоставлении с клоном SP142 выявлено, что общее процентное соответствие (точность) метода с использованием клона PBM 1A4 составило 84,21%, чувствительность 92,31%, специфичность 80,00%, положительная прогностичеcкая ценность (PPV) 70,59%, отрицательная прогностическая ценность (NPV) 95,24%. Показатели согласованности с другими клонами PD-L1 были ниже (каппа Коэна для SP263 оказался равен 0,496, а для 22С3 – 0,097959). Общее процентное соответствие (точность) метода с использованием клона PBM 1A4 составило 60% по отношению к клону SP263, чувствительность 20%, специфичность 86,67%, положительная прогностичеcкая ценность (PPV) 50%, отрицательная прогностическая ценность (NPV) 61,9%. Точность метода с использованием клона PBM 1A4 составила 56,41% по отношению к 22С3, чувствительность 54,55%, специфичность 57,14%, PPV – 33,33%, NPV – 76,19%.

Обсуждение результатов исследования

Экспрессия клона антител PBM-1A4 к PD-L1 и ее взаимосвязь с клинико-морфологическими параметрами рака желудка

Экспрессия отечественного клона антител ранее никогда не оценивалась в злокачественных новообразованиях желудка. В литературе имеются лишь единичные публикации с клоном PBM-1A4 в других солидных опухолях [9]. В нашем исследовании частота выявления PD-L1(PBM-1A4)-позитивных опухолей составила 46,2% от всех исследованных случаев, что несколько превышает опубликованные ранее данные по экспрессии PD-L1, выявленной другими клонами антител [10]. PD-L1(PBM-1A4)-позитивные опухоли значимо чаще относятся ко второму макроскопическому типу по R. Bormann (р=0,011), среди них значимо преобладают тубулярные аденокарциномы (р=0,042). Эти данные совпадают с литературными, поскольку с помощью других клонов антител к PD-L1 показано, что к PD-L1-позитивным новообразованиям относятся в основном тубулярные аденокарциномы желудка [7] [11, 12]. Других статистических различий между PD-L1(PBM-1A4)-негативными и PD-L1(PBM-1A4)-позитивными опухолями по клинико-морфологическим параметрам не выявлено.

Таким образом, впервые на крупной выборке операционного материала от пациентов с раком желудка выполнено исследование экспрессии отечественного клона антител к PD-L1 (PBM 1A4). Данный клон антител выявляет значительную часть новообразований желудка, при которых пациентам показана иммунотерапия, что является существенным прорывом в отечественных медицинских технологиях. Впервые для данного клона антител показано преобладание тубулярных аденокарцином желудка и аденокарцином 2 типа по R.Bormann.

Сопоставление экспрессии различных клонов PD-L1 при раке желудка

Из всех валидированных ранее методик наибольшую согласованность с экспрессией PBM 1A4 демонстрирует клон SP142 (Roche, Ventana). Показатель согласованности (каппа Коэна) результатов диагностики оказался равен 0,67335 (95% ДИ 0,43954 до 0,90716, стандартная ошибка 0,11929), что может трактоваться как существенная согласованность. При сопоставлении с клоном SP142 выявлено, что чувствительность метода с использованием клона PBM 1A4 составила 92,31%, а отрицательная прогностическая ценность (NPV) 95,24%. Специфичность составила 80,00%, что требует от производителя проведения дальнейших исследований и возможной модификации состава вспомогательных реагентов. 

Заключение

Экспрессия PD-L1, выявленная клоном антител PBM-1A4 представлена в 46,2% образцов рака желудка. Среди PD-L1(PBM-1A4)-позитивных опухолей значимо преобладают новообразования второго макроскопического типа по R.Bormann и тубулярные аденокарциномы. Других корреляций с клинико-морфологическими параметрами не выявлено.

Наибольшую согласованность с экспрессией PBM 1A4 демонстрирует клон SP142 (существенная согласованность, каппа Коэна равна 0,67335). Таким образом, данный клон антител, несомненно, представляет собой чрезвычайно перспективную разработку отечественных ученых, позволяющую сделать молекулярную диагностику злокачественных новообразований доступнее для российских пациентов.

About the authors

Tatyana Nikolaevna Sotnikova

Author for correspondence.
Email: docsotnikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6482-1110
SPIN-code: 4609-6164
Russian Federation

References

Supplementary files