Evaluation of the inflammatory response in the ovary after exposure to local electron irradiation and administration of platelet-rich plasma

Full Text

Обоснование

Проведение радиотерапии злокачественных новообразований органов малого таза может приводить к радиационно-индуцированному повреждению здоровых тканей яичника с развитием преждевременной недостаточности яичников и бесплодия [1]. Существуют общие механизмы развития воспалительной реакции в ответ на воздействие ионизирующего излучения, полезные в контексте лечения злокачественных новообразований, но опасные для окружающих здоровых тканей. В течение первых суток после облучения происходит пиковая активация каскадов цитокинов и факторов роста, таких как: TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IFN, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-18, TGF-β и др. [2] При этом авторы указывают, что концентрация перечисленных цитокинов обычно является зависимой от времени и дозы, и снижается в течение трех дней. Однако, другие исследования, проведенные через 3 дня после γ-облучения демонстрировали сохранение повышенных уровней экспрессии IL-6, TNF-α и IL-1β по сравнению с контрольной группой [3].

Не менее важную роль в запуске воспалительной реакции в ответ на первичную гибель клеток путем апоптоза (в результате накопления нерепарируемых мутаций молекулы ДНК) играют сигнальные пути NF-κB, MAPK/ERK, PI3K/Akt, TNF-α, а также активация инфламмасом NLRP-3 и др. [4, 5] Так, происходит дисбаланс между провоспалительными (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α и др.) и противовоспалительными (IL-4, IL-10, TGF-β, простагландин Е2 и др.) факторами с развитием воспалительной реакции [6]. Это приводит к рекрутированию макрофагов и клеточной инфильтрации в органах [7].

В некоторых экспериментальных исследованиях авторы демонстрировали развитие воспалительной реакции в яичниках в ответ на воздействие ионизирующего излучения. Одним из наиболее изученных сигнальных путей, активируемых облучением в яичниках, является TGF-β/MAPK [8]. Опубликованы данные о развитии дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов [9 – 11], однако практически отсутствуют исследования, посвященные детекции и CD-иммунотипированию воспалительных клеток в яичниках после воздействия облучения электронами.

Не менее интересным представляется изучение влияния предлучевого введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP), в облученном яичнике с целью протекции от воздействия электронами [12]. Этот регенеративный субстрат содержит в своем составе многочисленные факторы роста и другие биологически активные молекулы, обладающие противовоспалительным действием, что потенциально может уменьшить радиационно-индуцированное воспаление и снизить диапазон и глубину постлучевого повреждения яичников [13]. Проведение подобных исследований необходимо как для оптимизации процесса подбора доз при радиотерапии злокачественных новообразований малого таза, так и для поиска эффективных средств профилактики радиационно-индуцированной овариальной недостаточности.

Цель

Оценка воспалительной реакции в яичнике после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, в модели радиационно-индуцированной овариальной недостаточности.

Материалы и Методы

Животные – крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n=40) были поделены на четыре группы:

I группа (n=10) – контрольная;

II группа (n=10) – фракционное локальное облучение электронами в суммарной очаговой дозе (СОД) 20 Гр на линейном ускорителе электронов «NOVAC-11» (Италия);

III группа (n=10) – интраперитонеальное введение бедной лейкоцитами плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP), за 1 час до локального облучения электронами в СОД 20 Гр;

IV группа (n=10) – интраперитонеальное введение LP-PRP.

Животных всех групп выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика (кетамин + ксилазин) на 7 сутки эксперимента (датой начала эксперимента считали последний день облучения). Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985), «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Морфологическое исследование

После извлечения оценивали внешний вид яичников и состояние паренхимы на разрезе, взвешивали (в граммах) и измеряли. Затем нарезали параллельно сагиттальной плоскости каждые 2 мм, фиксировали в формалине, после проводки (аппарат гистологической проводки тканей, «Leica Biosystems», Германия) заливали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные срезы (толщиной 3 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования.

Для оценки эстрального цикла проводили окрашивание клеток из влагалища по Папаниколау в соответствии со стандартной методикой. Нормальный эстральный цикл включал стадии диэструса, проэструса, течки и метеструса. Процент нормальной цикличности определяли как отношение количества крыс с нормальными эстральными циклами к общему количеству крыс в каждой группе.

Морфологический анализ проводили в 10-ти случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении ×400 в 5-ти рандомных срезах с каждого образца. Цифровые изображения гистологических срезов (отсканированные препараты) для морфометрических исследований получали с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM3000, Германия; камера DFC450 C; компьютер Platrun LG) и программного обеспечения для обработки и анализа изображений Leica Application Suite (LAS) Version 4.9.0.

Иммуногистохимическое исследование

В качестве первичных использовали поликлональные антитела к интерлейкину-1β (IL-1β; ThermoFisher, 1:100, США), интерлейкину-4 (IL-4; ThermoFisher, 1:100, США), интерлейкину-6 (IL-6; ThermoFisher, 1:100, США), интерлейкину-10 (IL-10; ThermoFisher, 1:100, США), а также поликлональные антитела ready-to-use (RTU; Leica) к CD3 и CD20. Для определения вторичных антител использовались универсальная двухкомпонентная система детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system, («Cell Marque», США), анти-IGG мыши/кролика, пероксидаза хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ×400 (отношение числа окрашенных клеток к количеству всех клеток интерстициальной ткани в поле зрения × 100 %).

Статистический анализ

Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows (IBM Analytics, США). Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SD). Для оценки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. При сравнении исследуемых групп при распределении, отличном от нормального, применяли критерий Краскела-Уоллиса с апостериорным критерием Данна. Множественные сравнения проводили при помощи U-теста Манна-Уитни. Значение p≤0,05 считали статистически значимым.

Результаты

В контрольной группе во всех случаях (100 %) наблюдали нормальный эстральный цикл, состоящий из четырех стадий: диэструса, проэструса, течки и метеструса. Облучение электронами в суммарной дозе 20 Гр привело к снижению количества животных с нормальным циклом (40 %) во II-ой группе. Предлучевое введение LP-PRP сопровождалось менее выраженными изменениями эстрального цикла (60%).

При микроскопическом исследовании яичников контрольной и IV-ой групп на 7 сутки эксперимента наблюдали нормальное строение: поверхностно расположенный мезотелий покрывает снаружи белочную оболочку (слой плотной волокнистой соединительной ткани) глубже, в корковом веществе – фолликулы, находящиеся на разных стадиях развития (Рис. 1).

После фракционного локального облучения электронами в СОД 20 Гр отмечали признаки радиационно-индуцированной овариальной недостаточности: резкое снижение доли примордиальных, первичных, вторичных и третичных фолликулов в сочетании с увеличением количества атретических фолликулов, пикноз в некоторых ооцитах, частичную фрагментацию клеток гранулезной оболочки, мелкие кровоизлияния в строму органа, утолщение соединительнотканных тяжей, а также стаз в просвете кровеносных сосудов (Рис. 1).

В то же время, в яичниках III-ей группы предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, привело к менее выраженным радиационно-индуцированным нарушениям гистоархитектоники по сравнению со II-ой группой: наблюдали незначительное уменьшение доли примордиальных, первичных, вторичных и третичных фолликулов в сочетании с появлением небольшого числа атретических фолликулов, а также единичные кровоизлияния в строму и стаз в просвете кровеносных сосудов (Рис. 1).

При иммуногистохимическом исследовании яичников с антителами к провоспалительным (IL-1β, IL-6) и противовоспалительным (IL-4, IL-10) цитокинам после воздействия локального облучения электронами в СОД 20 Гр отмечали резкое увеличение экспрессии IL-1β (в 4,6 раза) и IL-6 (в 4,8 раза) по сравнению с контрольной группой, при этом уровни иммуномечения на IL-4 и IL-10 превышали контрольные значения лишь в 3,2 раза и в 2,7 раза, соответственно (Рис. 1).

Предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, привело к менее выраженному возрастанию уровней экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-1β – в 1,7 раза, IL-6 – в 2,0 раза) по сравнению с контрольной группой, а противовоспалительные цитокины демонстрировали практически аналогичные значения и превышали в 1,4 раза (IL-4) и в 1,4 раза (IL-10) контрольные показатели (Рис. 1).

В яичниках IV-ой группы через неделю после начала эксперимента не отмечали статистически значимых изменений уровней про- и противовоспалительных цитокинов по сравнению с контрольной группой.

При иммуногистохимическом исследовании яичников с антителами к общим маркерам Т-клеток (CD3) и В-клеток (CD20) после воздействия локального облучения электронами детектировали как CD3+, так и CD20+ иммунокомпетентные клетки, расположенные преимущественно периваскулярно, причем их количество значительно превышало контрольные показатели в 2,0 раза и в 1,6 раза, соответственно (Рис.2). При количественном анализе отмечали преобладание CD3+ иммунокомпетентных клеток (в 1,2 раза) относительно доли CD20+ лимфоцитов в яичниках II-ой группы (Рис. 3).

Предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, снижало выраженность CD3+ и CD20+ клеточной воспалительной инфильтрации в яичниках III-ей группы по сравнению с контролем в 1,1 раза, а доля CD3+ лимфоцитов превышала количество CD20+ лимфоцитов (Рис. 2, Рис. 3).

В яичниках IV-ой группы через неделю после начала эксперимента не отмечали статистически значимых изменений маркирования CD3 и CD20 по сравнению с контрольной группой.

 

Обсуждение

По результатам микроскопического исследования выявили признаки радиацонно-индуцированной овариальной недостаточности: гибель клеток фолликулов, кровоизлияния в строму органа, стаз в просвете кровеносных сосудов и увеличение доли атретических фолликулов, вероятно, связанные с воздействием локального облучения электронами в СОД 20 Гр во II-ой группе. Так, можно говорить о постлучевой гибели клеток фолликулов, опосредованной как прямым путем (генерация мутаций в молекуле ДНК), так и косвенно с образованием высоких концентраций токсичных свободных радикалов (продукты радиолиза воды, перекисного окисления липидов и др.) [14].

Накопление молекулярных паттернов, связанных с повреждением, или DAMPs (HMGB1, мочевой кислоты, белков теплового шока и др. в результате появления продуктов апоптоза клеток, токсических радикалов, мутантного генетического материала и др.), в яичниках приводит к генерации про- и противовоспалительных цитокинов [15]. Их увеличение подтверждено результатами проведенного нами иммуногистохимического исследования с антителами к IL-1β, IL-6 и IL-4, IL-10, причем во II-ой группе преобладали провоспалительные цитокины, что, вероятно, свидетельствует о цитокиновом дисбалансе с экспоненциальным высвобождением провоспалительных факторов и истощением локальной противовоспалительной защитной системы. Подобные данные были получены и в работах других исследователей [10, 11, 16].

Это приводит к миграции Т- и В-иммунокомпетентных клеток в строму яичника с развитием клеточной воспалительной инфильтрации, обнаруженной нами при иммуногистохимическом исследовании с антителами к CD3 и CD20. Интересно, что в проведенном исследовании во II-ой и III-ей группах мы отметили значительное увеличение доли CD3+ иммунокомпетентных клеток по сравнению с количеством CD20+ лимфоцитов, что указывает на преобладание Т-клеточного иммунитета над В-клеточным в яичниках после воздействия локального облучения электронами. В дальнейших исследованиях возможно проведения подробного CD-типирования иммунокомпетентных клеток с целью определения конкретных типов, ответственных за воспаление в яичнике в ответ на воздействие ионизирующего излучения.

В то же время, спустя неделю после последней фракции локального облучения электронами, в группе предлучевого введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, отмечали более низкую степень воспалительной реакции по сравнению с показателями II-ой группы, подтвержденную уровнями экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов, а также маркеров Т- и В-клеточного иммунитета, следует отметить преобладание первого над вторым, аналогичное результатам II-ой группы. Интересно, что при иммуногистохимическом исследовании в данной группе уровни провоспалительных цитокинов были приближены к значениям экспрессии противововспалительных цитокинов, что свидетельствует о сохранении цитокинового баланса и, возможно, позволяет косвенно говорить о радиопротекторных свойствах плазмы, обогащенной тромбоцитами, в том числе – о ее противовоспалительном эффекте в яичниках. Вероятно, это связано с большим количеством биологически активных веществ в ее составе, обладающих как антиоксидантным, так и противовоспалительным действием [17, 18]. Первое заключается в снижении степени радиационно-индуцированного оксидативного стресса, генерации токсических радикалов и предотвращении апоптоза клеток (таким образом снижается количество DAMP как одних из ключевых индукторов воспаления), а второе доказано в многочисленных исследованиях и сочетается с индукцией механизмов репарации во многих тканях [19 – 21].

Таким образом, на основании проведенных гистологического и иммуногистохимического исследований, продемонстрировано, что в ответ на воздействие локального облучения электронами в яичниках запускается локальная воспалительная реакция, частично нивелируемая предлучевым введением плазмы, обогащенной тромбоцитами, что может свидетельствовать о ее радиопротекторных (противовоспалительных и антиоксидантных) свойствах, которые могут быть полезными при разработке средств профилактики радиационно-индуцированной овариальной недостаточности.

 

Заключение

Компоненты плазмы, обогащенной тромбоцитами, обладая противовоспалительным и радиопротективным свойствами, уменьшают выраженность воспалительной реакции (на основании анализа уровней экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов) и количество Т- и В- иммунокомпетентных клеток, что приводит к замедлению развития радиационно-индуцированной овариальной недостаточности при воздействии фракционного локального облучения электронами в суммарной дозе 20 Гр.

About the authors

Grigory Demyashkin

Sechenov University; Medical Radiological Research Center named after A.F. Tsyba - branch of the Federal State Budgetary Institution "National Medical Research Center of Radiology" of the Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: dr.grigdem@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8447-2600
SPIN-code: 5157-0177

Doc. Med. Sci., Head of the Laboratory of Histology and Immunohistochemistry, ITM&B, Sechenov University; Head of the Department of Pathomorphology, National Research Center for Radiology

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8/2; 249036, Russia, Obninsk, Koroleva st., 4

Zaira Murtazalieva

Sechenov University

Email: ZARIA.ALIEVA.90@BK.RU
ORCID iD: 0009-0000-2361-7618

graduate student of ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8/2

Ekaterina Pugacheva

Sechenov University

Email: rouzella@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-2268-3838

graduate student of ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8/2

Matvey Vadyukhin

Sechenov University

Email: vma20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6235-1020
SPIN-code: 9485-7722

graduate student at the ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8/2

Milana Shukiurova

Sechenov University

Email: Milana.Shukyurova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0009-7740-9190

graduate student at the ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8/2

Sergey Koryakin

MRRC named after A.F. Tsyba - branch of the Federal State Budgetary Institution "National Medical Research Center of Radiology" of the Ministry of Health of Russia

Email: korsernic@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0128-4538
SPIN-code: 8153-5789

Candidate of Biological Sciences, Head of the Department of Radiation Biophysics, MRRC named after A.F. Tsyba - branch of the Federal State Budgetary Institution "National Medical Research Center of Radiology" of the Ministry of Health of Russia

Russian Federation, 249036, Russia, Obninsk, st. Koroleva, 4

Arina Proskuriakova

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: proskuryakova-02@list.ru
ORCID iD: 0009-0002-7319-7492

graduate student of the ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8/2.

References

Supplementary files