Morphometric Study of Skin Vessels After Mechanical Injury Based on von Willebrand Factor Antibody Labeling

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Регенерационный гистогенез является частью репаративной регенерации тканей. При заживлении травм различной этиологии этот процесс протекает сходным образом и подчиняется общеизвестным закономерностям. Наиболее важные гистологические процессы регенерации разворачиваются в гистотопографических зонах, выделенных гистологами Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова: раневой канал, область первичного травматического некроза, перинекротическая область [1]. В данном гистологическом исследовании проанализированы именно эти участки биоптатов кожи. Важным фактором, определяющим ход событий после механической травмы, является реакция сосудов микроциркуляторного русла [2]. Достаточная васкуляризация критически важна для пополнения резерва малодифференцированных клеток и формирования оптимального количества межклеточного вещества соединительных тканей. Известно, что благоприятный исход заживления кожных ран сопряжён с формированием на месте дефекта грануляционной ткани — особого типа ткани, созревание которой невозможно без участия гемокапилляров [3]. В научных исследованиях идентифицировать кровеносные сосуды можно с применением разнообразных гистологических методов. Наиболее широко используется обзорная окраска тканей гематоксилином и эозином [4, 5]. Однако, такой метод недостаточно селективен для достоверного изучения морфометрических показателей сосудов на препаратах. Кроме того, после окрашивания гематоксилином и эозином затруднено использование автоматизированных систем анализа изображений (например, ImageJ) из-за недостаточной специфичности окраски сосудов [6]. Ряд авторов [7–9] описывает хорошую визуализацию эндотелиоцитов на гистологических препаратах при иммуногистохимическом (ИГХ) окрашивании с использованием антител к фактору фон Виллебранда (vWF). Исходя из этого, в данном экспериментальном исследовании мы использовали методику ИГХ, чтобы проследить динамику количества сосудов, участвующих в регенерационном гистогенезе, и особенности их морфологии.

Фактор фон Виллебранда — это большой мультимерный гликопротеин плазмы крови и субэндотелиального матрикса, который также содержится в тельцах Вейбеля–Паладе в эндотелиальных клетках и в α-гранулах тромбоцитов [10]. Было показано, что vWF играет определённую роль в возникновении воспалительных реакций. Так, мультимеры vWF и тромбоциты, прикреплённые к повреждённому эндотелию, способствуют активному притоку лейкоцитов, что создаёт условия для распространения воспаления [11]. По имеющимся в литературе данным, выработка vWF эндотелиоцитами происходит тремя способами: в результате конститутивного и регулируемого экзоцитоза телец Вейбеля–Паладе, а также путём экзоцитоза с участием аутофагосом [12, 13]. Экзоцитоз vWF активируется при различных условиях, включая воспаление, повреждение сосудов, гипоксию и ещё ряд патологических факторов. Эндотелиальные клетки являются главным источником циркулирующего в крови vWF. Данные о роли фактора фон Виллебранда в ангиогенезе противоречивы. Некоторые авторы отмечают, что его отсутствие способствует ангиогенным процессам, что проявляется значимым повышением уровня пролиферации эндотелиальных клеток in vitro [14]. Кроме того, экспериментальные данные указывают на фактор фон Виллебранда как на ингибитор ангиогенеза, зависимого от сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular Endothelial Growth Factor — VEGF). Полагают, что vWF, депонированный в эндотелии, ограничивает пролиферацию эндотелиальных клеток, индуцированную фактором роста VEGF. Тем не менее, в отношении других типов тканевых клеток был отмечен противоположный эффект. При повреждении стенки крупного сосуда vWF может проникать в интиму и вступать в контакт с гладкомышечными клетками. Депонирование фактора фон Виллебранда в интиме сопровождается её утолщением, что указывает на то, что vWF способствует пролиферации клеток. Исследования in vitro показали, что vWF напрямую стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток [12]. Тем не менее, при всей неоднозначности функций мультимеров vWF, иммуногистохимическая реакция с использованием антител против этого белка позволяет точно маркировать эндотелий кровеносных сосудов, тогда как лимфатические сосуды не окрашиваются. В связи с этим, ИГХ метод может быть крайне полезным в комплексных исследованиях, поскольку он позволяет получить достоверные данные о количестве и калибре кровеносных сосудов на разных стадиях регенерационного гистогенеза, а также установить корреляции между этими показателями и фазой регенерации.

Цель исследования — с помощью иммуногистохимической реакции с антителами к фактору фон Виллебранда выявить динамику количества и размеров сосудов кожи на разных этапах регенерационного гистогенеза после механической травмы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое сплошное контролируемое рандомизированное неослеплённое исследование. Объекты исследования — фрагменты кожи средней трети бедра крыс линии Wistar на разных сроках заживления после нанесения глубокой резаной раны. Биоптаты использовали для приготовления парафиновых срезов и постановки иммуногистохимической реакции с антителами к фактору фон Виллебранда. Изображения препаратов оцифровывали для дальнейшего анализа динамики общего числа видимых на срезе сосудов и их морфометрических характеристик — оценки локализации и площади сечения каждого сосуда.

Критерии соответствия

В исследование было включено 27 крыс в возрасте 1,0–1,5 месяца, исходной массой 180–200 г.

Условия проведения

Экспериментальная часть работы выполнена в условиях сертифицированного вивария Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины Министерства обороны РФ (Соглашение о научном сотрудничестве № 15 между Военно-медицинской академией имени С.М. Кирова и ГНИИИ ВМ МО РФ от 13.09.2023 г.). Морфометрическая и статистическая обработка выполнена на кафедре гистологии с курсом эмбриологии ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Продолжительность исследования

Иссекали лоскуты кожи в области ранения с прилежащими визуально нормальными тканями спустя 12 ч, 24 ч, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток после повреждения. Выведение животных из эксперимента проводили путём передозировки смеси тилетамина и золазепама (препарат Золетил 50® (10 мг/кг; Virbac, Франция)) в комбинации с ксилазином (10 мг/кг; Pharmamagist Ltd., Венгрия) при внутримышечном введении.

Описание медицинского вмешательства

После разделения крыс на группы их содержали в отдельных промаркированных клетках, одна клетка на каждый срок взятия экспериментального материала. Манипуляции с животными проводили в утренние часы. Каждой особи внутримышечно вводили смесь Золетила® и ксилазина в дозе 10 мг/кг каждого препарата. С помощью острого скальпеля наносили повреждение в виде глубокого поперечного разреза кожи средней части бедра. Протяжённость разреза в длину варьировала от 1,5 до 2,0 см. Поскольку целью было моделирование контаминированной раны, первичную хирургическую обработку раны не проводили и повязку не накладывали. После нанесения повреждения животных помещали в соответствующую клетку до достижения определённого срока регенерации.

Взятие экспериментального материала — иссечение лоскута кожи в месте ранения с прилежащими нормальными тканями проводили через 12 ч, 24 ч, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток после повреждения. В качестве интактного контроля использовали кожу неповреждённых конечностей крыс.

Основной исход исследования

В рамках представленной работы ИГХ окрашивание срезов позволило идентифицировать эндотелий кровеносных сосудов, что дало возможность применить автоматизированный метод (программа Zen 2.3; Zeiss, Германия) для подсчёта кровеносных сосудов и определения их морфометрических показателей (площадь сечения и локализация) в рамках исследования фаз раневого процесса.

Анализ в группах

Всех крыс разделили на следующие группы: контрольная группа (n = 3) — интактные особи (выводили из эксперимента в его начале); остальные группы формировали в соответствии с временными точками выведения животных из эксперимента — спустя 12 ч, 24 ч, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток после нанесения механической травмы (n = 3 для каждой группы).

Методы регистрации исходов

Иммуногистохимическое исследование. Для выявления экспрессии vWF иммуногистохимические реакции проводили с применением соответствующих специфических поликлональных антител (Agilent, США, каталожный номер A008202) в разведении 1:400. Образцы кожи фиксировали в забуференном 10% растворе формалина в течение суток, после чего перекладывали в 96% этиловый спирт. После прохождения всех этапов проводки материал заливали в парафиновые блоки в специальных пластиковых кассетах. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ручном санном микротоме Sakura (Япония) и помещали на предметные стёкла с полилизиновым покрытием. Далее стёкла со срезами просушивали в термостате в течение 12 часов при температуре 37°C. Препараты депарафинизировали в двух сменах ксилола (по 10 мин каждая), регидратировали в спиртах нисходящей концентрации (две смены 96% этанола по 5 мин каждая, одна смена 80% этанола — 5 мин) и промывали в дистиллированной воде (5 мин). Препараты помещали в цитратный буфер S 1700 (Dako, Дания), предварительно нагретый в термостате до 60°С. Тепловое демаскирование антигена проводили в пароварке в течение 20–25 минут. Промывали срезы в дистиллированной воде (5 мин) и помещали в 3% раствор пероксида водорода (Н₂О₂) на 10 мин. Далее, после промывки, препараты перекладывали в 0,01М раствор фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4; Биолот, Россия) на 5 минут. Для блокировки неспецифического связывания антител использовали блокировочный раствор (Protein Block DP-125, Spring Bioscience, США), 10 мин при комнатной температуре. После удаления блокировочного раствора наносили раствор первичных антител к vWF. Препараты помещали во влажную камеру и инкубировали 24 ч при температуре 27°С. После инкубации с первичными антителами стёкла промывали в двух сменах PBS и наносили анти-кроличьи вторичные реагенты (Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System; Spring Bioscience, США), конъюгированные с полимером для связывания с соответствующими первичными антителами и с пероксидазой хрена для детекции. Инкубацию проводили во влажной камере в термостате при температуре 27°С в течение 30–40 минут. После промывки в PBS на срезы наносили рабочий раствор хромогенного субстрата 3,3’-диаминобензидин тетрагидрохлорида (Dako, Дания). Образование окрашенного продукта реакции происходило в течение 1–3 мин. После достижения оптимальной окраски срезов, контроль которой осуществляли под микроскопом, препараты промывали в 3% растворе пероксида водорода (3 смены по 5 мин). На финальном этапе срезы промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в изопропиловом спирте и смеси изопропилового спирта с ксилолом (1:1), просветляли в ксилоле и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Thermo Scientific, США). Для визуализации результатов ИГХ реакции применяли световой микроскоп Zeiss Axio Scope.A1 со встроенной фотокамерой Zeiss Axiocam ERc 5s (Zeiss, Германия).

Морфометрическое исследование. Для морфометрического анализа оцифрованных изображений со светового микроскопа Zeiss Axio Scope.A1 со встроенной фотокамерой Zeiss Axiocam ERc 5s использовали лицензионное программное обеспечение Zen 2.3. Меченые эндотелиоциты визуализировали в области раневого канала, первичного некроза и в перинекротической зоне — по 10 полей зрения на каждую из областей. В автоматизированном режиме при помощи опции «точки» подсчитывали количество сосудов, образованных мечеными клетками. Далее, при помощи встроенной опции «сплайн» вычисляли площадь каждого обнаруженного сосуда. Числовые данные заносили в таблицы Excel для формирования графиков.

Статистический анализ

Принципы расчёта размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных. Количественные данные в тексте статьи приведены в виде арифметического среднего и стандартного отклонения (M ± SD). Оценку статистической значимости различий количественных признаков между экспериментальными группами не проводили.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты исследования

Фрагменты кожи средней трети поверхности бедра крыс линии Wistar после нанесения глубокой резаной раны. Биоптаты размером 1,5–2,0 см включали раневой канал и окружающие его визуально нормальные ткани.

Основные результаты исследования

Благодаря высокой селективности выбранного метода маркирования кровеносных сосудов и применению автоматизированной системы подсчёта и морфометрии цифровых изображений удалось классифицировать обнаруженные структуры на 4 группы, исходя из средней площади видимого просвета (S_ср): 0–100 мкм² — малые; 101–500 мкм² — средние; 501–1000 мкм² — крупные; < 1000 мкм² — очень крупные. Мы не ставили перед собой задачу выяснить принадлежность каждого сосуда к артериальному или венозному руслу и при характеристике фаз раневого процесса учитывали лишь их количество, калибр, а также расположение относительно слоёв кожи.

При исследовании препаратов интактной кожи было выявлено всего 3 кровеносных сосуда в составе гиподермиса: 2 крупных (S_ср = 604,16 ± 0,61 мкм²) и 1 очень крупный (S_ср = 2578 мкм²; рис. 1).

Рис. 1. Интактная кожа бедра крысы — крупный сосуд в составе дермы; иммуногистохимическое окрашивание с антителами к фактору фон Виллебранда; объектив ×40, окуляр ×10.

Fig. 1. Intact skin of the rat thigh. A large blood vessel in the dermis. Immunohistochemical staining with anti–von Willebrand factor antibodies; objective ×40, eyepiece ×10.

Обращает на себя внимание тот факт, что сосуды малого калибра в интактной коже ни в одно поле зрения не попали. Однако на препаратах травмированной кожи уже в фазу некроза, что соответствует сроку 12–24 часа, обнаружено 7 сосудов малого калибра в составе сетчатого слоя дермы: 4 сосуда на сроке 12 ч эксперимента и 3 — на сроке 24 часа (рис. 2).

Рис. 2. Кожа бедра крысы спустя 2-е суток после нанесения механической травмы — мелкие сосуды в составе дермы в перинекротической зоне; иммуногистохимическое окрашивание антителами к фактору фон Виллебранда; объектив ×63, окуляр ×10.

Fig. 2. Skin of the rat thigh on day 2 after mechanical injury. Small blood vessels in the dermis within the perinecrotic area. Immunohistochemical staining with anti–von Willebrand factor antibodies; objective ×63, eyepiece ×10.

На более поздних сроках, соответствующих фазе воспаления (начиная с 3 суток эксперимента), наблюдается положительная динамика количества сосудов малого калибра вплоть до 10 суток, когда происходит взрывной рост их количества. Если к 6 суткам мы видим небольшое увеличение числа мелких сосудов (11 сосудов) по сравнению с 3 сутками эксперимента (9 сосудов), то на препаратах 10 суток их насчитывается уже 37 (S_ср = 35,28 ± 3,32 мкм²). Сосуды среднего калибра обнаруживаются на препаратах интактной кожи. Их количество последовательно прогрессирует на начальных фазах раневого процесса: 2 сосуда на препаратах спустя 24 ч после травмы (S_ср = 244,54 ± 1,42 мкм²), 4 — к 6-м суткам (S_ср = 209,00 ± 4,81 мкм²), 6 — к 10-м суткам (S_ср = 190,86 ± 1,43 мкм²). Сосуды малого и среднего калибра мы наблюдали в основном в дерме кожи, тогда как наиболее крупные сосуды встречаются только в составе гиподермиса. Аналогично срезам интактной кожи, на которых был обнаружен 1 очень крупный сосуд, на препаратах после травмы найдены очень крупные сосуды с той же локализацией спустя 12 ч (S_ср = 4296,04 мкм²) и 24 часа (S_ср = 2986,45 мкм²). Однако на некоторых сроках, например, на 3 сутки, мы не выявили ни одного такого сосуда. В поле зрения также попадали единичные сосуды крупного калибра (S_ср = 698,75 мкм² на 6 сутки и 788,40 мкм² на 10 сутки).

На основании гистологического исследования препаратов на 15 и 25 сутки эксперимента — срок, соответствующий фазе адаптации, можно констатировать, что в этот период происходит значительное снижение васкуляризации исследуемой области. В фазе адаптации мы видим единичный очень крупный сосуд (S_ср = 1173,95 мкм²), отсутствие сосудов крупного и среднего калибра и, в отличие от предыдущих периодов, значительное снижение количества малых сосудов: на препаратах 15 суток насчитывается 21 сосуд (S_ср = 79,62 ± 2,12 мкм²), на препаратах 25 суток — уже всего 7 (S_ср = 54,47 ± 3,36 мкм²).

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Регенерация соединительных тканей кожи протекает с участием кровеносных сосудов, о чём свидетельствуют различия в количестве и калибре сосудов кожи крыс между нулевой фазой регенерационного гистогенеза и последовательными фазами раневого процесса.

Особую роль в регенерации резаной раны играют, по всей вероятности, сосуды малого калибра (площадь сечения ≤ 100 мкм²). Количество таких сосудов неуклонно растёт до 10 суток эксперимента, что соответствует фазе пролиферации/дифференцировки. Именно количество сосудов малого калибра демонстрирует наиболее яркую динамику (рис. 3). На более поздних сроках (15 и 25 суток после травмы) их количество снижается. Наиболее крупные сосуды во всех исследованных временных точках обнаруживаются только в составе гиподермиса и в единичном количестве. Поэтому для уточнения их морфологических особенностей в раневом процессе требуются дальнейшие исследования.

Рис. 3. Динамика количества кровеносных сосудов в зависимости от фазы раневого процесса.

Fig. 3. Changes in blood vessel count across the phases of the wound healing process.

Обсуждение основного результата исследования

Раневой процесс представляет собой сложный комплекс ответных реакций организма на повреждение, характеризующийся фазностью течения. Принято выделять четыре фазы (некроз; воспаление; пролиферация и дифференцировка; адаптация), через которые проходят все раны, но степень выраженности этих фаз различается. Немаловажную роль в регенерационном гистогенезе играет реакция сосудов микроциркуляторного русла. Иммуногистохимический анализ кровеносных сосудов в разные фазы раневого процесса показал, что наиболее выраженные изменения затрагивают количество малых кровеносных сосудов, локализованных в большинстве своём на уровне сетчатого слоя дермы в перинекротической области резаной раны (рис. 4).

Рис. 4. График зависимости количества кровеносных сосудов различного калибра от срока после нанесения механической травмы кожи.

Fig. 4. Graph showing the number of blood vessels of different calibers in relation to the time elapsed after mechanical skin injury.

На препаратах кожи бедра крыс через 12 и 24 часа после механической травмы мы наблюдаем увеличение количества видимых сосудов, что согласуется с результатами экспериментальных работ прошлых лет. Было показано, что в первые часы после ранения повреждённые ткани частично «выключаются» из кровотока, а впоследствии этот эффект сменяется первыми признаками воспалительной реакции — артериальной и венозной гиперемией с увеличением объёма васкуляризации. При проведении ИГХ исследования мы наблюдали аналогичную картину: спустя 12 часов после травмы на препаратах обнаруживаются только единичные капилляры не всех обозначенных калибров, но уже к концу первых суток vWF-положительные клетки эндотелия визуализируются значительно чаще. Известно, что при раневом процессе гиперемия сопровождается повышением сосудистой проницаемости. Это способствует миграции в рану лейкоцитов, высвобождению гидролитических ферментов, разрушающих микроорганизмы и мертвые клетки, что обеспечивает очищение раны. Кроме того, усиливается секреция (фактора некроза опухоли и интерлейкинов), индуцирующих воспаление. Через 1–2 суток в рану мигрируют моноциты, трансформирующиеся в макрофаги, а к 3–4 суткам они становятся преобладающими клеточными элементами в области повреждения. Роль макрофагов заключается в фагоцитозе некротизированных клеток и инородных частиц, а также в выделении факторов гемостаза и факторов роста, активирующих различные регенеративные процессы, включая ангиогенез [15]. Результаты нашего исследования указывают на то, что третьи сутки раневого процесса можно назвать стартовой точкой устойчивого прогрессирующего роста количества мелких и средних кровеносных сосудов. В дальнейшем, в результате деятельности фибробластов, образуется грануляционная ткань, правильное развитие которой обеспечивает благоприятное течение процесса заживления. Однако для нормального функционирования фибробластов необходимы кислород, аминокислоты и микроэлементы [16]. Их поступление обеспечивает процесс неоангиогенеза из интактных сосудов, расположенных в перинекротической области [2]. Если ангиогенез происходит недостаточно активно, то миграция фибробластов замедляется, вплоть до полного её прекращения и остановки процесса заживления. В нашем исследовании внешняя картина заживления экспериментальных ран свидетельствует об активном образовании хорошо васкуляризированного регенерата, что подтверждается результатами ИГХ окрашивания.

Некоторые авторы наблюдали наибольший объём новообразованных сосудов к 10–14 суткам после ранения, что согласуется с нашими данными [17]. Этот период относится к фазе пролиферации и дифференцировки в рамках раневого процесса. В нашем исследовании все раны заживали первичным натяжением и после контрольной временной точки в 10 суток мы регистрировали постепенное снижение количества сосудов. Это внешне проявлялось в виде формирования тонких рубцов, которые постепенно изменяли свой цвет с красного, обусловленного большим количеством сосудов, на более светлый — розовый или почти белый.

Необходимо учитывать, что последовательная смена фаз раневого процесса всегда имеет индивидуальные особенности. Так, при высокой степени загрязнённости раны микроорганизмами и девитализированными тканями длительность воспалительной фазы может кратно увеличиваться. Мы исследовали контаминированные раны, поэтому течение их регенерации у разных особей имело разную степень вариабельности — удаление некротизированных тканей, формирование струпа, образование грануляционной ткани и соединительнотканного рубца происходило в разное время. Однако все процессы проходили согласно общим закономерностям регенерационного гистогенеза.

Ограничения исследования

Данные о корреляции между фазой раневого процесса и количеством кровеносных сосудов в регенерате, полученные в нашем исследовании, в целом согласуются со сведениями из литературных источников. Однако, мы полагаем, что использованная выборка могла быть недостаточной для достоверного исследования динамики наиболее крупных сосудов кожи. Кроме того, основываясь на данных литературы последних лет, можно заключить, что маркирование антителами к vWF позволяет селективно выявить именно кровеносные, но не лимфатические сосуды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённого исследования можно утверждать, что для установления фазы раневого процесса и выявления динамики ангиогенеза в регенерате при экспериментальном исследовании резаных кожных ран оптимальным является применение иммуногистохимического метода окрашивания с использованием антител к фактору фон Виллебранда. Этот метод позволяет получать гистологические препараты высокого качества и использовать их для дальнейшего морфометрического анализа кровеносных сосудов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Т.И. Березовская — концепция и дизайн исследования, написание и редактирование текста статьи, подготовка статьи к публикации, подбор иллюстративного материала; Г.В. Коняев — поисково-аналитическая работа, написание текста статьи, подготовка статьи к публикации и её редактирование. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Условия содержания и кормления экспериментальных животных соответствовали принципам биоэтики и «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Хельсинкская декларация, 2000 г.), а также закону «О защите животных от жестокого обращения» (глава V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.); приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г., приказу МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Протокол проведения исследований был одобрен комиссией независимого локального этического комитета ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ. Выписка из протокола заседания Локального этического комитета от 17.10.2023 г. (протокол № 283).

Источники финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: T.I. Berezovskaya: conceptualization, methodology, writing—original draft, writing—review & editing, project administration, visualization. G.V. Konyaev: investigation, writing—original draft, writing—review & editing, project administration. All authors approved the final version of the manuscript and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring the accuracy and integrity of any part of the article.

Ethics approval: The housing and feeding conditions of the experimental animals complied with bioethical standards and the Guidelines for Working with Experimental Animals (Helsinki Declaration, 2000), as well as the Russian Federal Law On the Protection of Animals from Cruelty (Chapter V, Article 104679-GD dated December 1, 1999); Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 267 dated June 19, 2003, and Order On Approval of the Rules of Good Laboratory Practice No. 199n dated April 1, 2016. The study protocol was approved by the Independent Local Ethics Committee of the S.M. Kirov Military Medical Academy, Ministry of Defense of the Russian Federation. Extract from protocol of the Local Ethics Committee No. 283, dated October 17, 2023.

Funding sources: The authors declare no external funding for this research.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

About the authors

Tatyana I. Berezovskaya

Email: lapi2@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-1591-9152
SPIN-code: 2508-7042
Russian Federation, Saint Petersburg

Grigory V. Konyaev

Author for correspondence.
Email: Grisha061000@gmail.com
ORCID iD: 0009-0009-9584-5973
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Intact skin of the rat thigh. A large blood vessel in the dermis. Immunohistochemical staining with anti–von Willebrand factor antibodies; objective ×40, eyepiece ×10.

Download (177KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Skin of the rat thigh on day 2 after mechanical injury. Small blood vessels in the dermis within the perinecrotic area. Immunohistochemical staining with anti–von Willebrand factor antibodies; objective ×63, eyepiece ×10.

Download (107KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Changes in blood vessel count across the phases of the wound healing process.

Download (150KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Graph showing the number of blood vessels of different calibers in relation to the time elapsed after mechanical skin injury.

Download (149KB)

Indexing metadata