Glomerular filtration barrier of rat kidneys in acute OPs poisoning

Full Text

Анализ нефротоксичности фосфорорганических соединений (ФОС) проведен рядом исследований, включающих как исследование случаев хронической болезни почек неясной этиологии у человека, так и исследования на животных моделях [13, 15, 30]. Результаты данных исследований позволяют только косвенно судить об участии ФОС в развитии патологии почек. В микрокартине срезов тканей почек, полученных при остром и хроническом воздействии вещества, обнаруживают нарушение канальцевого эпителия, интерстициальный фиброз, а также значительный гломерулосклероз, сопряженный с легким или средним повреждением тубулярных эпителиальных клеток (ТЭК) как проксимальных (ПК), так и дистальных (ДК) канальцев [8, 17, 31]. ФОС распространены в современном мире в виде инсектицидов и акарицидов в сельском хозяйстве и в быту. Эти соединения способны проникать в организм человека сквозь кожные покровы, слизистые оболочки, дыхательные пути при несоблюдении техники безопасности, неаккуратном обращении с этими веществами [9]. ФОС паратион, метаболитом которого является пароксон, классифицирован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) как стойкий органический загрязнитель Ia класса токсичности и характеризован как чрезвычайно опасный [22]. Главным механизмом воздействия подавляющего большинства представителей ФОС является необратимое ингибирование фермента ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в нервно-мышечных синапсах, приводящее к чрезмерной стимуляции никотиновых и мускариновых рецепторов центральной и периферической нервной системы, что определяет их основные патологические эффекты. Метаболиты ФОС выводятся из организма почками.

Почечные тельца нефрона почек являются местом фильтрации плазмы крови, а гломерулярный фильтрационный барьер – структурной единицей сквозь которую осуществляется фильтрация. ГФБ представляет собой уникальную морфологическую структуру, образованную фенестрированными эндотелиальными клетками (ЭК), выстилающими внутреннюю поверхность клубочковых капилляров, гломерулярной базальной мембраной (ГБМ) и висцеральными эпителиальными клетками, называемыми подоцитами, имеющими разветвленные ножковые отростки I-го, II-го, III-го порядков [6, 29]. Эти структурные элементы взаимосвязаны путями перекрестного взаимодействия, из которых наиболее разъясненным является ось VEGFA–eNOS / NO–ET–1, предполагающая взаимозависимую работу всех элементов фильтрационного барьера [4, 26]. Отдельно для нефрона также описана тубулогломерулярная обратная связь, определяемая различием концентрации ионов Cl– в просветной жидкости канальца, воспринимаемой клетками плотного пятна [23]. Для осуществления фильтрации и поддержания избирательной проницаемости сквозь ГФБ фенестрации ЭК покрыты гликокаликсом, а ножковые отростки подоцитов III-го порядка объединены между собой щелевыми диафрагмами, основным белком в составе которых является нефрин. Последними исследованиями избирательной проницаемости ГБМ, эта мембрана в составе ГФБ, определена как гелеобразная структура, селективная по размеру проникающей молекулы. Так проникновение макромолекул в толщу ГБМ обусловлено размером самих молекул [14, 25]. Электронно-микроскопическое исследование почек мышей, зафиксированных от нескольких секунд до нескольких часов после инъекции меченого золотом альбумина, парвоальбумина и овоальбумина, демонстрируют неспособность проникновения в плотную пластинку наночастиц, молекулярной массой 300 кДа, при этом частицы с молекулярной массой 150 кДа способны проникнуть до некоторой степени, а частицы с молекулярной массой 66 кДа интенсивно проникают в толщу плотной пластинки ГБМ, накапливаясь вблизи отростков подоцитов III-го порядка [16]. Все элементы ГФБ имеют крайне малые размеры и нуждаются в ультраструктурном исследовании для определения нарушений, вызванных острым или хроническим воздействием ФОС. В настоящее время наиболее уязвимым элементом нефрона принято считать ТЭК канальцев [8, 17, 31].

Для моделирования острой интоксикации ФОС приобретают решающее значение внутривидовые особенности животного. Воздействие ФОС изучалось на различных животных моделях: на грызунах, приматах, свиньях, водных организмах, представителях типа Plathelmintes, сопряженных с применением различных способов введения токсиканта: внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного, подкожного, контактного, ингаляционного и перорального [19, 20, 28]. Морские свинки, нечеловекообразные приматы и люди имеют низкие уровни циркулирующих карбоксилэстераз (КЭ), способных метаболизировать и инактивировать ФОС, сокращая объем их воздействия на клетки выделительных органов [19]. Однако крысы сейчас остаются наиболее часто применяемым видом лабораторных животных и продолжают использоваться в токсикологических экспериментах с ФОС [10, 19, 21]. Этот вид имеет физиологические особенности, в частности, наличие в плазме крови высокой активности КЭ, способной стехиометрически связать ФОС, поступающих в кровяное русло [12]. В литературе предложены различные модели острого отравления крыс ФОС, предполагающие этап предварительного ингибирования КЭ плазмы крови введением специфического ингибитора 2-(о-крезил)-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-2-оксида (CBDP) или двукратным введением суммарной дозы изучаемого вещества. Эти модели предполагают изучение токсичности ФОС у крыс, сопоставимых с отравлением у человека .

Учитывая то обстоятельство, что выбор животной модели в опытах острой и хронической токсичности ФОС требует особой тщательности и учета видовых особенностей животного, а также учитывая существование необходимости изучения изменений ГФБ в результате острого воздействия токсиканта на ультраструктурном уровне исследование является актуальным.

Цель

Выявление морфологических изменений среди элементов ГФБ почек крыс в результате острого отравления сублетальными дозами ФОС на примере параоксона в 3-х моделях отравления.

Материалы и Методы

Образцы тканей почек для исследования были получены от крыс в 3-х экспериментальных моделях отравления. Эксперименты по моделированию интоксикации крыс выполнены доктором биологических наук Гончаровым Н.В. в НИИ "Гигиены, профпатологии и гигиены и экологии человека" ФМБА России в рамках проекта Российского научного фонда № 16-15-00199 "Разработка эффективных средств профилактики, терапии и предотвращения отсроченных последствий отравлений фосфорорганическими соединениями". Исследуемые группы: контроль (n=15) – интактные животные, получившие 1 мл 0,9% раствора NaCl; М1 (n=15) – животные, подвергнутые воздействию параоксона в сублетальной дозе ЛД50 250 мкг/кг; М2 (n=15) – животные, подвергнутые двукратному интервальному воздействию параоксона в дозах 110 мкг/кг и 150 мкг/ кг с временным интервалом 1 ч; М3 (n=15) – животные, подвергнутые воздействию специфического ингибитора КЭ CBDP в дозе 3,3 мг/кг и параоксона в дозе 150 мкг/кг с временным интервалом 1 ч. Введение препаратов – параоксон, CBDP, 0,9 % NaCl, производили подкожно. Через 1, 3 и 7 суток после отравления животных каждой группы выборочно подвергали декапитации, после чего из коркового слоя почек вырезали фрагменты, размером 0,5х0,5 см, и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и 2,5% глутаровом альдегиде на фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,2-7,4.

Для визуализации структурных белков ГФБ – нефрина и коллагена IV типа проводили иммуногистохимическое исследование. Образцы почек дегидратировали и заключали в парафин. Использовали антитела к нефрину и коллагену IV типа (Sigma-Aldrich, США). Демаскировку антигена проводили путем нагревания в цитратном буфере рН 6,0 в микроволновой печи, срезы почек с антителами инкубировали во влажной камере при температуре +4 С° в течение ночи, для визуализации применяли систему детекции Reveal-Biotin-Free Polivalent AP (Spring Bioscience Co., США) согласно инструкции производителя.

Фрагменты почек, фиксированные в 2,5% глутаровом альдегиде, дофиксировали 2% раствором OsO₄ на ФСБ (рН 7,2-7,4), обезвоживали стандартно, заливали в смолу Аралдит (ESM, США). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, ультратонкие срезы, толщиной 80 нм, контрастировали 1% водным раствором уранилацетата (Serva, Германия) и цитратом свинца по Рейнольдсу, затем исследовали в электронном микроскопе Merlin (Zeiss, Германия).

Морфометрию проводили на электронограммах 4-х интракортикальных клубочков для каждого животного, применяя метод, описанный Bgatova et al. [3]. Измеряли диаметр и количество фенестраций ЭК клубочковых капилляров в тестовом отрезке 2 мкм, ширину подошвенной части и количество ножковых отростков цитоподий подоцитов III-го, порядка примыкающих к ГБМ в тестовом отрезке 2 мкм, толщину ГБМ, высоту ТЭК ПК, ТЭК ДК.

Полученные числовые данные анализировали при помощи программы GraphPadPrizm 5.0. Нормальность распределения определяли, применяя тесты Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. При нормальном распределении данных использовали сравнение при помощи однофакторного теста ANOVA с поправкой Бонферони, при ненормальном распределении данных – сравнение проводили с использованием непараметрического теста Краскела-Уоллиса для множественных сравнений, с использованием критерия Данна. Отличия признавали статистически значимыми при р ˂ 0,05. Данные в тексте представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (M±SD).

Результаты

Экспрессия основных структурных белков – нефрина и коллагена IV типа, поддерживающих целостность ГФБ почек, у отравленных животных после отравления была сопоставима с показателями животных контрольной группы (Рис. 1). В результате острого отравления сублетальными дозами экспрессия эти белков оказалась ненарушенной.

А	Б
В	Г

Рисунок 1 – Экспрессия нефрина в капиллярном клубочке почечного тельца в контрольной (А) и экспериментальной группах на 3-и (Б), сутки после отравления; экспрессия коллагена IV типа в капиллярном клубочке почечного тельца в контрольной (В) и экспериментальной группах на 7-е (Г) сутки после отравления. Окрашивание антителами к нефрину и коллагену IV типа, хромоген DAB, увеличение х 1000 (А, Б), х 400 (В, Г)

Figure 1 - Expression of nephrin in renal tubule capillary in control (A) and experimental groups on the 3rd (B) day after poisoning; expression of type IV collagen in renal tubule capillary in control (C) and experimental groups on the 7th (D) day after poisoning. Staining with antibodies to nephrin and type IV collagen, DAB chromogen, magnification x 1000 (A, B), x 400 (C, D)

Морфометрические показатели компонентов ГФБ у животных контрольной и экспериментальных групп показаны в Таблице.

Морфометрические показатели компонентов ГФБ у животных контрольной и экспериментальных групп в 1-е и 7-е сут после отравления (M±SD)

Morphometric indices of GFB components in animals of control and experimental groups in the 1st and 7th days after poisoning (M±SD)

Показатель	Сутки	Контроль	М1	М2	М3
Количество фенестраций ЭК в тестовом отрезке 2 мкм, ед	1	10,0±1,9	9,66±1,7	9,78±1,5	6,55±1,1***
	7	10,0±1,9	9,00±2,2	7,45±1,6***	7,71±2,1*
Диаметр фенестраций ЭК, мкм	1	0,08±0,02	0,12±0,03***	0,08±0,02	0,10±0,02
	7	0,08±0,02	0,10±0,02*	0,10±0,03*	0,09±0,02
Толщина ГБМ, мкм	1	0,18±0,02	0,18±0,02	0,17±0,06	0,20±0,05**
	7	0,18±0,02	0,21±0,05***	0,22±0,09***	0,18±0,05
Количество цитоподий подоцитов в тестовом отрезке 2 мкм, ед	1	5,93±1,8	7,20±1,9	7,40±1,3*	6,70±1,8
	7	6,07±1,8	6,29±1,5	6,04±1,5	6,71±1,5
Ширина подошвенной части цитоподий подоцитов, мкм	1	0,20±0,09	0,221±0,13	0,20±0,09	0,25±0,15
	7	0,19±0,07	0,170±0,07	0,27±0,15***	0,27±0,18**
Высота ТЭК ПК, мкм	1	11,52±2,9	12,70±4,3	12,07±2,8	13,44±3,8*
	7	11,52±2,9	10,61±3,1	11,71±2,8	13,56±2,8*
Высота ТЭК ДК, мкм	1	8,72±2,4	6,02±2,1***	8,59±2,3	9,59±2,2
	7	8,72±2,4	7,23±3,3	10,43±2,9*	8,57±2,6

Примечание: *р ≤ 0,05, ** р ≤ 0,01, *** р ≤ 0,001 по сравнению с контрольной группой.

 

Количество фенестраций ЭК в тестовом отрезке 2 мкм изменилось относительно контрольных значений в 1-е сут после отравления в модели М3, а также в 7-е сут после отравления в моделях отравления М2 и М3. При этом радиус фенестраций изменился в 1-е сут в модели отравления М1, и в 7-е сут в моделях отравления М1 и М2. В модели М3 по этому показателю отличий не выявлено (Таблица).

Изменение толщины ГБМ в 1-е сут выявлено в модели отравления М3, на 7-е сут это отличие по сравнению с контрольной группой отсутствовало. При этом в моделях отравления М1 и М2 выявлено увеличение толщины ГБМ в 7-е сут по сравнению с контролем (Таблица).

Количество цитоподий подоцитов в тестовом отрезке 2 мкм ГБМ увеличилось в 1-е сутки только в модели отравления М2, в других экспериментальных группах отличия в сравнении с контролем не обнаружено. Средние показатели ширины подошвенной части цитоподий подоцитоов статистически значимо увеличивались в моделях отравления М2 и М3 (Таблица).

Высота ТЭК ПК и ТЭК ДК изменялась в 1-е и 7-е сут. Выявлено увеличение высоты в ТЭК ПК в модели отравления М3 в 1-е и 7-е сут после отравления, сокращение высоты ТЭК ДК в модели М1 в 1-е сут и увеличение высоты в модели М2 в 7-е сут (Таблица). После острого отравления в моделях М2 и М3 наблюдалось тенденция к гипертрофическим изменениям среди ТЭК ДК, а в модели М1 наблюдалось кратковременное уплощение клеток (Таблица).

На срезах клубочков почек основные структурные нарушения ГБМ преимущественно локализовались непосредственно под ЭК. Структурные изменения, обнаруженные в ГБМ отравленных животных, были схожи между экспериментальными группами и были выражены в появлении неравномерной толщины ГБМ, образовании разреженных участков ГБМ под телами ЭК и под тонким слоем цитоплазмы фенестрированного эндотелия. Были обнаружены участки удвоения ГБМ. Нарушение целостности мембраны, наличие осмиофильных электронно-плотных депозитов в толще ГБМ не обнаружено (Рис. 2). Щелевые диафрагмы между отростками подоцитов III-го порядка были сохранны во всех исследуемых группах (Рис. 2)

А	Б	В
Г	Д	Е
Ж	З	И

Рисунок 2 – Ультрамикроскопические изменения ГФБ почек в 3-х моделях отравления. Фенестрации ЭК клубочковых капилляров на 3-и сутки после отравления, в группе контроля (А), М1 (Б), М2 (В). Обзорные участки фенестраций указаны стрелками. Структурные изменения ГБМ, спустя 7 суток после отравления в группе контроля (Г), М2 (Д), М3 (Е). Черные стрелки – нарушение гомогенной структуры ГБМ под эндотелием, белая стрелка – отслаивание ЭК. Черная пустая стрелка – сохранность щелевых диафрагм. Признаки повреждения ТЭК ПК, обнаруживаемые у всех групп отравленных животных: появление фаголизосом в цитоплазме ТЭК (белые стрелки), нарушение микроворсинок апикальной поверхности ТЭК (черные стрелки), звездочками показаны клетки с увеличением осмиофильности цитоплазмы (Ж); кариопикноз ТЭК (стрелка) (З); нарушение базального лабиринта ТЭК (стрелка) (И). Трансмиссионная электронная микроскопия, масштабный отрезок 200 nm (А, Б, В), 1 µm (Г, Д, Е), 2 µm (Ж, З, И)

Figure 2 - Ultramicroscopic changes of renal GFB in 3 models of poisoning. Fenestrations of ECs of tubular capillaries on the 3rd day after poisoning, in control group (A), M1 (B), M2 (C). Fenestration sites are indicated by arrows. Structural changes of GBM, 7 days after poisoning in control group (D), M2 (E), M3 (E). Black arrows - disruption of the homogeneous structure of GBM under the endothelium, white arrow - peeling of EC. Black empty arrow - preservation of slit diaphragms. Signs of PC TEC damage found in all groups of poisoned animals: appearance of phagolysosomes in the cytoplasm of TEC (white arrows), disruption of microvilli of the apical surface of TEC (black arrows), asterisks show cells with increased cytoplasm osmiophilicity (E); karyopicnosis of TEC (arrow) (G); disruption of the basal labyrinth of TEC (arrow) (H). Transmission electron microscopy, scale bar 200 nm (A, B, C), 1 µm ( D, E, А), 2 µm (E, G, H)

Обсуждение

В исследовании показано изменение элементов ГФБ почек крыс при остром отравлении ФОС на примере параоксона в 3-х различных моделях отравления. Изменения, наблюдаемые в ГФБ отравленных животных проявляются схоже, что объясняется представленными в литературе данными о схожести проявления септических, токсических и гипоксических воздействий на клетки почек [2].

Восстановление целостности ТЭК ПК наблюдалось к 7-м суткам после отравления, что согласуется с восстановлением тубулярных клеток у человека при непреднамеренном отравлении [31]. ТЭК канальцев способны к регенерации, пролиферации и миграции, т.е. механизмам восполнения поврежденной ткани [18].

Экспрессия основных структурных белков, поддерживающих целостность ГФБ, нефрина и коллагена IV типа, оказалась сохранна и сопоставима между экспериментальными и контрольной моделями отравления. Обнаружение нефрина в цитоплазме подоцитов свидетельствует о сохранной метаболической активности этих клеток в результате острого отравления. Это также подтверждается сохранностью щелевых диафрагм подоцитов, основным структурным белком которой является нефрин. Согласно литературе нефрин выступает в качестве связующего звена между ножковыми отростками подоцитов III-го порядка, сохраняя актиновый цитоскелет подоцита в физиологичном положении, преотвращая сглаживание цитоподий и развитие протеинурии [15]. Подоциты – это клетки не способные к пролиферации, однако они обладают подвижным цитоскелетом, способным к сокращению [15]. Поврежденные подоциты подвергаются гипертрофическим изменениям, способны перестраивать актиновый цитоскелет цитоподий, для компенсации «незакрытых» участков ГБМ [15].

Нарушение микроциркуляции крови, вызванное острым отравлением ФОС подразумевает гипоксическое воздействие на клетки почек [1]. Ишемическое и реперфузионное повреждение клеток почек, появление аномального уровня различных циркулирующих факторов в результате отравления, способны формировать дисфункцию у ЭК [26]. В литературе описан мускариновый рецептор AChM1R клеток почек [24], обуславливающий изменения, наблюдаемые в ЭК клубочковых капилляров. Наиболее выраженные изменения в исследовании наблюдались со стороны ЭК. Изменение диаметра фенестраций ЭК и изменение количества фенестраций в тестовом отрезке 2 мкм были обнаружены во всех экспериментальных моделях на 7-е сут после отравления. На рисунке 3 показана схема элементов ГФБ, в которых были выявлены изменения на 7-е сут после отравления.

Рисунок 3 – Схематичное изображение компонентов ГФБ почек крыс в 3-х моделях отравления. Рамкой охвачены компоненты ГФБ, в которых определялись изменения на 7-е сутки после острого отравления

Figure 3 - Schematic representation of GFB components of rat kidneys in 3 models of poisoning. The frame covers GFB components, in which changes were determined on the 7th day after acute poisoning

Как показало исследование, элементы ГФБ при остром отравлении параоксоном изменяются взаимосвязано. Так при увеличении толщины ГБМ в 7-е сутки после отравления в модели отравления М2, в эти же сроки наблюдения сокращается количество фенестраций в фиксированном отрезке с одновременным увеличением величины их диаметра, ширины цитоподий и увеличением количества ножек подоцитов на том же фиксированном отрезке. При увеличении толщины ГБМ в 1-е сутки после отравления в модели отравления М3 наблюдается снижение количества фенестраций на фиксированном отрезке при одновременном увеличении их диаметра и увеличении ширины цитоподий подоцитов. В группе без предварительного ингибирования КЭ наблюдается лишь увеличение диаметра фенестраций ЭК клубочковых капилляров.

Динамика структурных изменений, происходящих в ГБМ отличается в разных группах в зависимости от способа ингибирования КЭ, так при однократном (М1) и двукратном (М2) введении параоксона изменения схожи и выражаются последовательным увеличением толщины мембраны, а при введении CBDP (М3) увеличение толщины мембраны, наблюдаемое в 1-е сутки, сокращается к 7-м суткам после отравления. Вероятно, увеличение трансгломерулярного транспорта в этой группе вероятно привело к накоплению белка в толще ГБМ в 1-е сут, к 7-м сут подоциты устранили избыток белков из ГБМ, сократив ее толщину [16]. Помимо нарушения избирательной проницаемости и накопления белка в толще мембраны вероятен аномальный синтез компонентов ГБМ, вызванный острой токсической нагрузкой при разобщении метаболизма подоцитов и эндотелиальных клеток [7]. Это дополнительно демонстрирует дисфункцию ЭК клубочковых капилляров, приводящую к накоплению макромолекул в толще ГБМ [4, 11].

В нашем случае в моделях отравления М2 и М3 в 7-е сутки наблюдалось увеличение ширины подошвенной части ножковых отростков подоцита одновременно с увеличением толщины ГБМ. Что позволяет предположить изменения в актиновом цитоскелете этих клеток для компенсации открытых участков ГБМ. Перекрестное взаимодействие между подоцитами и эндотелиальными клетками по оси VEGFA–eNOS / NO–ET–1 позволяет поврежденным ЭК клубочковых капилляров путем высвобождения ET–1 стимулировать перестройку подоцитами актинового цитоскелета [11, 26].

Изменения в показателях ТЭК ДК наблюдались на 7-е сут после отравления в моделях М2 и М3. В литературе основным механизмом, влияющим на появление гипертрофических изменений клеток дистального канальца, считается увеличение Na+ содержащегося в просвете канальца [27]. При повреждении ТЭК ПК, определяемого в 1-е сут для всех моделей отравления, вероятно, Na+ / K+ – насос был временно утрачена, что привело к увеличению уровня содержания Na+ в просвете дистального канальца и вызвало последующую гипертрофию ТЭК ДК [18].

Выводы. 1. Острое отравление параоксоном во всех моделях отравления вызывает ультраструктурные изменения в ГФБ, выраженные в изменениях размера и количества фенестраций эндотелиальных клеток клубочковых капилляров, толщины и архитектуры ГБМ, ширины и количества отростков подоцитов III-го порядка.

2. Структурные изменения в коре почек крыс в моделях отравления с этапом предварительного ингибирования КЭ (М2 и М3) более выражены по сравнению с моделью отравления М1.

Заключение

Острое отравление ФОС вызывает ультрамикроскопические изменения в элементах ГФБ – ЭК клубочковых капилляров, ГБМ и подоцитах во всех моделях отравления параоксоном. Все выявленные изменения не определяются на микроскопическом уровне, создавая необходимость введения этапа ультрамикроскопического исследования тканей почек при исследовании нефротоксичности химических соединений.

Выявление изменений структурных элементов, образующих ГФБ, в результате острого отравления ФОС предоставило новую информацию для понимания механизмов их нефротоксичности. В данной работе были определены наиболее уязвимые элементы ГФБ, формирование дисфункции у которых способствует изменению прочих элементов барьера при остром отравлении ФОС. Нарушение ЭК благодаря перекрестным взаимодействиям с прочими клетками, способно спровоцировать изменения в цитоподиях подоцитов.

Наиболее уязвимыми при остром воздействии ФОС на примере параоксона оказались животные в модели отравления М2, подвергнутые предварительному ингибированию КЭ крови крыс путем двукратного интервального введения токсиканта. Полученные результаты позволяют предположить, что данный способ моделирования отравления при изучении острой токсичности ФОС на грызунах является наиболее оптимальным и данные, полученные при его применении, будут полезными для оценки риска для здоровья человека, контактирующего с ФОС.

Изменения, выявляемые в ГФБ, позволяют предположить возникновение нарушений почечных телец при хроническом отравлении, способных привести к гломерулосклерозу, тем самым сократив функциональную активность почек. Результаты исследования могут способствовать улучшению прогнозирования рисков и разработке превентивных мер, снижающих количество случаев острого и хронического отравления ФОС у человека, а также способствовать лучшему пониманию биологии клеток, формирующих фильтрационный барьер.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова Российской академии наук, государственное задание № 075-00263-25-00.

Соблюдение этических норм. Токсикологические эксперименты проведены в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике, положениями “Руководства по экспериментальному

(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ” [23], положениями “Руководства по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях” [24], “Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)” (РД 64-126-91) и требованиями Приказа Минздравсоцразвития РФ №708н от 23.08.2010. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Compliance with ethical norms. Toxicological experiments were conducted in accordance with the rules recommended by the Physiological Section of the Russian National Committee on Biological Ethics, the provisions of the “Guidelines for the Experimental

(preclinical) study of new pharmacological substances” [23], provisions of the ”Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances” [23], the provisions of the “Guidelines for Laboratory Animals and Alternative Models in Biomedical Research” [24], the “Rules for Preclinical Studies of New Pharmaceutical Substances [24], “Rules for preclinical safety assessment of pharmacological agents (GLP)” (RD 64-126-91) and requirements of the Order of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation № 708n from 23.08.2010. All applicable international, national and/or institutional principles of animal care and use were observed.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. В.Е. Соболев – планирование исследования, редактирование текста, научное руководство; Соколова М.О. – морфологическое исследование, обработка результатов, написание текста.

Author contribution. V.E. Sobolev - study planning, text editing, scientific guidance; M.O. Sokolova - morphological study, results processing, text writing.

About the authors

Margarita Sokolova

Military Medical Academy named S.M. Kirov of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: sokolova.rita@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3457-4788
SPIN-code: 3683-6054

Lecturer, Department of Biology

Russian Federation

Vladislav Sobolev

Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Email: vesob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7775-8205
SPIN-code: 1225-2853

Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher of the Center for Collective Use

Russian Federation, 194233, Russia, St. Petersburg, Toreza Ave., 44

References

Supplementary files