Association between age-related changes in rat choroid plexus and lipofuscin accumulation in epithelial cells

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Сосудистое сплетение головного мозга является основным источником спинномозговой жидкости (ликвора). Оно состоит из стромального компонента, включающего соединительнотканные элементы и кровеносные сосуды, и покровного эпителия, который иногда рассматривают вместе с эпендимой желудочков мозга как особую глиоэпендимную ткань, что связано с их общим происхождением [1, 2]. Некоторые исследования демонстрируют способность эпителия сосудистого сплетения к пролиферации в эксплантатах [3]. В то же время, есть работы, свидетельствующие о том, что эти клетки должны быть отнесены к популяции медленно обновляющихся, а у взрослых животных и человека их способность к обновлению вызывает сомнение. В связи с этим в клетках эпителия сосудистого сплетения, сходно с нейронами и кардиомиоцитами, должны обнаруживаться структурные и цитохимические признаки, характерные для реакций на оксидативный стресс и иные патологические эпизоды. С возрастом такие реакции могут проявиться в накоплении гранул липофусцина и меланина, а также в появлении внутриядерных и цитоплазматических включений [4]. Установлено, что у человека при естественном старении, а ещё чаще при возрастных патологиях (болезни Альцгеймера и других), в эпителии сосудистого сплетения появляются как липофусцин, так и особые цитоплазматические включения, содержащие похожие на липофусцин гранулярные структуры и амилоидные фибриллы — тельца Бионди [5]. У лабораторных животных, для которых характерна существенно меньшая продолжительность жизни, чем у человека, подобных проявлений возрастных изменений ранее описано не было. Исключением можно считать кроликов, у которых выявлено накопление липофусцина в сосудистом сплетении боковых желудочков головного мозга при включении в их рацион холестерина [6]. При этом в условиях естественного старения кроликов сосудистое сплетение не изучалось на предмет выявления признаков накопления липофусцина.

Цель настоящего исследования — проверить гипотезу о том, что для эпителия сосудистого сплетения головного мозга крыс характерно накопление липофусцина при старении.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое одномоментное выборочное исследование. Объектом исследования были сосудистые сплетения боковых желудочков головного мозга крыс разного возраста. Из парафиновых блоков изготавливали фронтальные срезы головного мозга, монтировали их на предметные стёкла, депарафинировали и заключали в перманентную среду.

Условия проведения исследования

Работа выполнена на базе ФГБНУ «ИЭМ». Головной мозг для исследования извлекали у самцов крыс линии Вистар, находящихся в глубоком эфирном наркозе. Образцы обезвоживали и подготавливали к заливке в парафин при помощи гистопроцессора Microm STP 120 (Microm, Германия). Оцифровка изображений проведена с использованием флуоресцентного Axio Observer Z1 (Zeiss, Германия) и конфокального LSM 800 (Zeiss, Германия) микроскопов.

Критерии соответствия

В работе использовали образцы головного мозга самцов крыс линии Вистар в возрасте: 4–5 месяцев (n =3), 18 месяцев (n =3), 28 месяцев (n =3).

Описание вмешательства

Головной мозг животных фиксировали в комбинированном фиксаторе цинк-этанол-формальдегид в течение 24 часов при комнатной температуре, обезвоживали и заливали в парафин. Фронтальные срезы головного мозга толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Rotary 3003 PFM Medical (PFM Medical, Германия) и монтировали на стёкла с адгезивным покрытием HistoBond+ (Paul Marienfeld, Германия). После депарафинирования и промывки срезы без предварительного окрашивания заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Часть препаратов окрашивали гематоксилином и эозином, анилиновым синим, толуидиновым синим, а также по методу Ниссля. Препараты анализировали с использованием микроскопии в проходящем свете видимого диапазона (микроскоп Leica DM 750; Leica Microsystems, Германия). Флуоресцентную микроскопию проводили на микроскопе Axio Observer Z1 (Zeiss, Германия). Для конфокальной микроскопии использовали микроскоп LSM 800 (Zeiss, Германия) под управлением программы ZEN Blue 2012 (Zeiss, Германия) и лазеры с длиной волны 405, 488 и 561 нм. Флуоресценцию детектировали в диапазонах 405–510 нм, 510–570 нм и 570–700 нм соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При исследовании неокрашенных препаратов в проходящем свете в нейронах и клетках сосудистого сплетения не обнаружено пигментных гранул. Применение разных методов обзорного окрашивания не помогло выявить гранулы в сосудистом сплетении, по тинкториальным свойствам сходные с типичными включениями липофусцина. При этом у крыс в возрасте 18 и 28 месяцев наблюдается увеличение пространства, занятого волокнистым компонентом стромы сосудистого сплетения.

При флуоресцентной микроскопии с использованием объектива малого увеличения EC Plan-Neofluar 10×/0,30M27 также не удалось выявить аутофлуоресцирующие гранулы, что, вероятно, связано с их малыми размерами и низкой интенсивностью флуоресценции.

Применение конфокальной лазерной микроскопии с использованием иммерсионного объектива Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC M27 позволило обнаружить на препаратах головного мозга крыс в возрасте 18 и 28 месяцев флуоресцирующие структуры, локализующиеся в эпителиоцитах сосудистого сплетения в виде цитоплазматических гранул размером 0,2–0,5 мкм (рис. 1). Эмиссия выявленных гранул соответствует диапазону 570–700 нм при возбуждении лазером с длиной волны 561 нм и диапазону 510–570 нм при возбуждении лазером 488 нм. Возбуждение светом с длиной волны 405 нм не индуцировало флуоресценцию выявленных гранул в диапазоне 405–510 нм.

Обнаруженные гранулы во всех случаях находятся вблизи апикальной части эпителиальных клеток и формируют небольшие кластеры по 5–20 гранул, иногда сливающихся между собой. Точные размеры выявленных структур не всегда удаётся определить из-за их малых размеров, сопоставимых с разрешающей способностью конфокального микроскопа. В отдельных случаях визуализировались более крупные гранулы (0,5–0,9 мкм) кольцевидной формы. Совмещение каналов флуоресценции показало, что в пределах отдельных кластеров флуоресценция неоднородна по спектральному составу и интенсивности. Преимущественно встречаются гранулы с флуоресценцией в зелёной и красной областях спектра (см. рис. 1).

 

Рис. 1. Фрагменты сосудистого сплетения в боковых желудочках головного мозга крыс: a–d — в возрасте 28 месяцев; e — 18 месяцев; f — 4–5 месяцев. Аутофлуоресценция липофусцина при возбуждении лазерами с длиной волны 561 нм (a), 488 нм (b) и 405 нм (с). Раздельное (a–c) и объединённое (d) представление каналов, стрелки указывают на гранулы липофусцина. Конфокальная лазерная микроскопия; масштабный отрезок 5 мкм.

Fig. 1. Fragments of the choroid plexus in the lateral ventricle of the rat brain: a–d, 28 months; e, 18 months; f, 4–5 months. Autofluorescence of lipofuscin under laser excitation at wavelengths of 561 nm (a), 488 nm (b), and 405 nm (c). Separate (a–c) and merged (d) channel views; arrows indicate lipofuscin granules. Confocal laser microscopy; scale bar, 5 μm.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Представленные результаты свидетельствуют о том, что в покровном эпителии сосудистого сплетения головного мозга крыс по мере старения накапливаются гранулы, обладающие способностью к аутофлуоресценции в зелёном и красном диапазонах видимого спектра. Для обнаружения таких гранул наиболее подходящим методом является конфокальная микроскопия. Известно, что у стареющих лабораторных животных (мышей и крыс) в головном мозге происходит накопление липофусцина [7], которое связывают с перекисным окислением липидов и повышением содержания продуктов лизосомальной деградации белков [8]. В этой связи гранулы, выявленные в сосудистом сплетении и аутофлуоресцирующие в широком диапазоне видимого спектра, вероятнее всего представляют собой липофусцин и липофусциноподобные включения. Правомерность такого допущения подкрепляется сходством биофизических свойств и биохимического состава липофусцинов у человека и крысы [9]. Следует отметить, что ранее возможность накопления липофусцина в сосудистом сплетении головного мозга крыс не рассматривалась, хотя известно, что клетки покровного эпителия сосудистого сплетения составляют важный компонент гематоликворного барьера [10]. Поскольку липофусцин накапливается преимущественно в клетках медленно обновляющихся популяций, таких как нейроны и кардиомиоциты, обнаружение липофусциновых гранул в клетках сосудистого сплетения может рассматриваться как косвенный признак их достаточно медленного обновления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты подтверждают гипотезу о возможности накопления липофусцина в эпителии сосудистого сплетения головного мозга у крыс при старении. Присутствие липофусцина в сосудистом сплетении может быть использовано в качестве дополнительного критерия, указывающего на патологический характер экспериментальных воздействий.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. О.В. Кирик — проведение исследования, работа с данными, визуализация, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи; О.С. Алексеева — проведение исследования, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи; М.С. Файзов — проведение исследования, написание черновика рукописи; Е.А. Федорова — проведение исследования, написание черновика рукописи; А.А. Бекетова — проведение исследования, написание черновика рукописи; Д.Э. Коржевский — определении концепции работы, проведение исследования, пересмотр и редактирование рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. При работе с животными (содержании и эвтаназии) соблюдали принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.) и «Правила надлежащей лабораторной практики» (приказ № 199н от 01.04.2016 г. Минздрава России). Проведение исследования одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 1/25 от 27.01.2025).

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» (FGWG- 2025-003) и государственного задания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук (№ 075- 00263-25-00).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. Авторы подтверждают оригинальность исследования, при проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Авторы предоставляют ограниченный доступ к данным (по запросу, после завершения периода эмбарго).

Генеративный искусственный интеллект. Авторы не использовали технологии генеративного искусственного интеллекта при создании настоящей стетьи.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: O.V. Kirik: investigation, formal analysis, visualization, writing—original draft; O.S. Alekseeva: investigation, writing—original draft; M.S. Faizov: investigation, formal analysis; E.A. Fedorova: investigation; A.A. Beketova: investigation, formal analysis; D.E. Korzhevsky: conceptualization, investigation, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: All procedures involving animals (housing and euthanasia) complied with the principles of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986) and with the Rules of Good Laboratory Practice (Order of the Ministry of Health of Russia No. 199n of April 1, 2016). The study was approved by the Local Ethics Committee of the Institute of Experimental Medicine (Minutes No. 1/25 of January 27, 2025).

Funding sources: This work was carried out as part of the state assignment of the Institute of Experimental Medicine (FGWG-2025-003) and the state assignment of the I.M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences (No. 075-00263-25-00).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: The authors confirm that this is an original study. No previously obtained or published material was used in this study or article.

Data availability statement: The authors provide limited access to the data upon reasonable request (after the embargo period has expired).

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewers, a member of the Editorial Board, and the in-house science editor.

About the authors

Olga V. Kirik

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
SPIN-code: 5725-8742

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Olga S. Alekseeva

Institute of Experimental Medicine; Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: osa72@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-5688-347X
SPIN-code: 4281-3091

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Murodali S. Fayzov

Institute of Experimental Medicine

Email: fayzov-1994@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-3411-3412
Russian Federation, Saint Petersburg

Elena A. Fedorova

Institute of Experimental Medicine

Email: el-fedorova2014@ya.ru
ORCID iD: 0000-0002-0190-885X
SPIN-code: 5414-4122

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasiya A. Beketova

Institute of Experimental Medicine

Email: beketova.anastasiya@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-8659-733X
SPIN-code: 6780-2677
Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitrii E. Korzhevsky

Institute of Experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-code: 3252-3029

Dr. Sci. (Medicine), professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files