ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОСУДИСТОГО СПЛЕТЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫСЫ СОПРОВОЖДАЮТСЯ НАКОПЛЕНИЕМ ЛИПОФУСЦИНА В КЛЕТКАХ ПОКРОВНОГО ЭПИТЕЛИЯ



Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Сосудистое сплетение головного мозга, являющееся основным источником спинномозговой жидкости, состоит из стромального и покровного эпителия, клетки которого относятся к популяции медленно обновляющихся тканей и могут накапливать липофусцин с возрастом по аналогии с другими клетками головного мозга.

Цель настоящего исследования состояла в проверке гипотезы о том, что для эпителия сосудистого сплетения головного мозга крысы характерно накопление липофусцина при старении.

Методы. Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар разного возраста: 4-5 мес (n=3), 18 мес (n=3), 28 мес (n=3). Наличие липофусцина в тканях оценивали с помощью конфокальной микроскопии, используя его свойство автофлуоресцировать.

Результаты. В ходе исследования было показано, что при старении происходит накопление липофусцина в эпителии сосудистого сплетения головного мозга у крыс.

Заключение. Дальнейшее изучение условий и экспериментальных воздействий, при которых накопление липофусцина может задерживаться, позволит разработать методологию тестирования новых медицинских технологий и препаратов, замедляющих старение структур головного мозга.

Полный текст

Обоснование

Сосудистое сплетение головного мозга являясь основным источником спинномозговой жидкости (ликвора), состоит из стромального компонента (соединительнотканных элементов, кровеносных сосудов), и покровного эпителия, который (по причине общего происхождения с эпендимой желудочков мозга) иногда рассматривают вместе с эпендимой в качестве особой глио-эпендимной ткани [1-2]. Несмотря на ранние исследования, демонстрировавшие способность эпителия сосудистого сплетения к пролиферации в эксплантатах [3], позднее были получены свидетельства того, что популяция этих клеток должна быть отнесена к медленно обновляющейся, а у взрослых животных и человека способность к обновлению данных клеток вызывает сомнение. В связи с этим клетки эпителия сосудистого сплетения должны демонстрировать (сходно с нейронами и кардиомиоцитами) структурные и цитохимические признаки имевших место реакций на оксидативный стресс и иные патологические эпизоды, которые, накапливаясь с возрастом, могут проявиться в накоплении гранул липофусцина, меланина и появлении различных внутриядерных и цитоплазматических включений [4]. Для сосудистого сплетения головного мозга человека было установлено, что при естественном старении и (чаще) при проявлениях возрастной патологии (болезнь Альцгеймера и др.) в эпителии сосудистого сплетения может появляться как липофусцин, так и особые цитоплазматические включения, которые содержат похожие на липофусцин гранулярные структуры и амилоидные фибриллы – тельца Бионди [5]. У лабораторных животных, которые характеризуются существенно меньшей продолжительностью жизни в сравнении с человеком, подобных проявлений возрастных изменений ранее зарегистрировано не было. Исключением можно считать кроликов, у которых при кормлении холестерином было выявлено появление липофусцина в сосудистом сплетении боковых желудочков головного мозга [6]. В условиях естественного старения сосудистое сплетение у кроликов на предмет выявления признаков накопления липофусцина не изучалось.

Цель

Цель настоящего исследования состояла в проверке гипотезы о том, что для эпителия сосудистого сплетения головного мозга крысы характерно накопление липофусцина при старении.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

В работе использовали головной мозг крыс-самцов Вистар разного возраста: 4-5 мес (n=3), 18 мес (n=3), 28 мес (n=3). При работе с животными (содержании и умерщвлении) соблюдали принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.) и «Правила надлежащей лабораторной практики» (приказ №199н от 01.04.2016 г. Минздрава России). Головной мозг животных фиксировали погружением в комбинированный фиксатор цинк-этанол-формальдегид в течение 24 часов при комнатной температуре, обезвоживали и заливали в парафин. Фронтальные срезы головного мозга толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Rotary 3003 PFM Medical (PFM Medical, Германия) и монтировали на стекла с адгезивным покрытием HistoBond+ (Paul Marienfeld, Германия). После депарафинирования и промывки срезы без предварительного окрашивания заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, Германия). Часть препаратов окрашивали гематоксилином и эозином, анилиновым синим, а также, по методу Ниссля, толуидиновым синим. Препараты анализировали с использованием микроскопии в проходящем свете видимого диапазона (микроскоп Leica DM 750). Флуоресцентную микроскопию проводили с использованием микроскопа Axio Observer Z1 (Zeiss, Германия). Для конфокальной микроскопии и регистрации автофлуоресценции использовали конфокальный микроскоп LSM 800 (Zeiss Германия) под управлением программы ZEN blue 2012 (Zeiss, Германия). Флуоресценцию вызывали, используя лазеры с длиной волны 405, 488 и 561 нм. Флуоресценцию регистрировали в диапазонах 405-510, 510-570 и 570-700 нм.

 

Этическая экспертиза

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 1/25 от 27.01.2025).

Результаты

При исследовании неокрашенных препаратов в проходящем свете не было обнаружено наличия пигментных гранул ни в нейронах, ни в клетках сосудистого сплетения. Применение обзорных окрасок не дало возможности выявить в сосудистом сплетении гранул, по тинкториальным свойствам сходных с типичными включениями липофусцина. При этом у животных 18 и 28 мес наблюдалось увеличение пространства, занятого волокнистым компонентом стромы сосудистого сплетения.

Флуоресцентная микроскопия с использованием объектива малого увеличения EC Plan-Neofluar 10x/0,30 M27 не дала возможности выявить автофлуоресцирующие гранулы, по-видимому, в связи с их малым размером и малой интенсивностью флуоресценции.

Применение конфокальной лазерной микроскопии с использованием иммерсионного объектива Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 позволило получить результаты, свидетельствующие о присутствии флуоресцирующего материала, представленного в эпителиоцитах в виде цитоплазматических гранул размером 0,2-1,0 мкм, на препаратах головного мозга крыс в возрасте 18-28 мес (рис. 1). Эмиссия выявленных гранул соответствовала диапазону 570-700 нм при возбуждении светом с длиной волны 561 нм и диапазону 510-570 нм при возбуждении светом с длиной волны 488 нм. Использование для возбуждения света с диной волны 405 нм не индуцировало флуоресценции выявленных гранул в диапазоне 405-510 нм.

Выявленные гранулы во всех случаях находились вблизи апикальной части эпителиальных клеток и формировали небольшие кластеры по 5-20 иногда сливающихся гранул. Точные размеры выявленных структур не всегда было возможно определить в связи с их малой величиной, сравнимой с разрешающей способностью конфокального микроскопа. В отдельных случаях можно было определить более крупные (0,5-0,9 мкм) гранулы кольцевидной формы. Совмещение каналов флуоресценции показывает, что в пределах отдельных кластеров флуоресценция неоднородна по спектральному составу и интенсивности. Преимущественно встречаются гранулы с зеленой и красной флуоресценцией (рис. 1).

 

 

Обсуждение

Представленные результаты свидетельствуют о том, что в покровном эпителии головного мозга крысы по мере старения происходит накопление гранул, обладающих способностью автофлуоресцировать в зеленом и красном диапазонах видимого спектра при возбуждении светом соответствующей длины волны. Для регистрации этого эффекта наиболее удобно использование конфокальной микроскопии. Учитывая то, что у стареющих лабораторных животных (мышей и крыс) в головном мозге наблюдают накопление липофусцина [7], присутствие которого связывают с перекисным окислением липидов и накоплением продуктов лизосомальной деградации белков [8], выявление в сосудистом сплетении автофлуоресцирующих в широком диапазоне видимого спектра гранул свидетельствует об их принадлежности к липофусцину и липофусциноподобным включениям. Правомерность такого допущения исходит из сходства биофизических свойств и биохимического состава липофусцинов человека и крысы [9]. Следует отметить, что ранее в сосудистом сплетении головного мозга крысы возможность накопления липофусцина не рассматривалась. Учитывая то, что липофусцин накапливается преимущественно в клетках медленно обновляющихся популяций (нейроны, кардиомиоциты) можно полагать, что накопление липофусциновых гранул в покровном эпителии сосудистого сплетения является косвенным признаком того, что обновление этих клеток, составляющих важный компонент гематоликворного барьера [10], осуществляется достаточно медленно.

 

Заключение

Таким образом в настоящем исследовании представлены факты, подтверждающие высказанную гипотезу о возможности накопления липофусцина в эпителии сосудистого сплетения головного мозга у крыс при старении. Дальнейшее изучение условий и экспериментальных воздействий, при которых происходит задержка накопления липофусцина, позволит разработать методологию тестирования новых медицинских технологий и препаратов, замедляющих старение структур головного мозга.

Подпись к рисунку

Фрагмент сосудистого сплетения в боковом желудочке головного мозга крысы. Регистрация автофлуоресценции липофусцина при возбуждении лазерами с длиной волны 561 нм (а), 488 нм (б) и 405 нм (в). Раздельное (а-в) и объединенное (г) представление каналов. Конфокальная лазерная микроскопия.

Масштабный отрезок равен 5 мкм

×

Об авторах

Ольга Викторовна Кирик

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
Scopus Author ID: 27171304100
ResearcherId: A-8710-2012

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Ольга Сергеевна Алексеева

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской академии наук

Email: osa72@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-5688-347X
Scopus Author ID: 7005782741
ResearcherId: B-4180-2012

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы 

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12; 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44

Елена Анатольевна Федорова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»

Email: el-fedorova2014@ya.ru
ORCID iD: 0000-0002-0190-885X
Scopus Author ID: 36901775900
ResearcherId: B-1671-2012

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Муродали Саидалиевич Файзов

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»

Email: fayzov-1994@mail.ru

аспирант лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Анастасия Алексеевна Бекетова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»

Email: beketova.anastasiya@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-8659-733X

лаборант-исследователь лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»

Email: DEK2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
Scopus Author ID: 12770589000
ResearcherId: C-2206-2012

доктор медицинских наук, профессор РАН, заведующий лабораторией функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Список литературы

  1. 1. Хлопин Н.Г. Общебиологические и экспериментальные основы гистологии. 1946. Из-во академии наук. 491 с.
  2. 2. Sarnat H.B. Histochemistry and immunocytochemistry of the developing ependyma and choroid plexus // Microsc. Res. Tech. 1998. V. 41, N 1. P. 14-28. doi: 10.1002/(SICI)1097-0029(19980401)41:1<14::AID-JEMT3>3.0.CO;2-U
  3. 3. Михайлов В.П. Рост и превращение in vitro покровных клеток сосудистых сплетений мозга // ДАН СССР. 1938. Т. 18, № 2. С. 121-122.
  4. 4. Hakvoort K., Otto L., Haeren R., Hoogland G., Schijns O., Vink H., Klein D., van Zandvoort M., Rijkers K. Shedding light on human cerebral lipofuscin: An explorative study on identification and quantification // J. Comp. Neurol. 2021. V. 529, N 3. P. 605-615. doi: 10.1002/cne.24971
  5. 5. Ghetti B., Schweighauser M., Jacobsen M.H., Gray D., Bacioglu M., Murzin A.G., Glazier B.S., Katsinelos T., Vidal R., Newell K.L., Gao S., Garringer H.J., Spillantini M.G., Scheres S.H.W., Goedert M. TMEM106B amyloid filaments in the Biondi bodies of ependymal cells // Acta Neuropathol. 2024. V. 148, N 1. P. 60. doi: 10.1007/s00401-024-02807-w
  6. 6. Obata F., Narita K. Hypercholesterolemia negatively influences morphology and molecular markers of epithelial cells within the choroid plexus in rabbits // Fluids Barriers CNS. 2020. V. 17, N 1. P. 13. doi: 10.1186/s12987-020-0175-0
  7. 7. Oenzil F., Kishikawa M., Mizuno T., Nakano M. Age-related accumulation of lipofuscin in three different regions of rat brain // Mech. Ageing Dev. 1994. V. 76, N 2-3. P. 157-163. doi: 10.1016/0047-6374(94)91590-3
  8. 8. Georgakopoulou E.A., Tsimaratou K., Evangelou K., Fernandez Marcos P.J., Zoumpourlis V., Trougakos I.P., Kletsas D., Bartek J., Serrano M., Gorgoulis V.G. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues // Aging (Albany NY). 2013. V. 5, N 1. P. 37-50. doi: 10.18632/aging.100527
  9. 9. Ottis P., Koppe K., Onisko B., Dynin I., Arzberger T., Kretzschmar H., Requena J.R., Silva C.J., Huston J.P., Korth C. Human and rat brain lipofuscin proteome // Proteomics. 2012. V. 12, N 15-16. P. 2445-2454. doi: 10.1002/pmic.201100668
  10. 10. Terman A., Brunk U.T. Lipofuscin // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36, N 8. P. 1400-1404. doi: 10.1016/j.biocel.2003.08.009

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор,


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.