Ultrastructural organization and reproduction virions in Vero (E6) cells i under conditions of infection with Delta and Omicron SARS-CoV-2.



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

Aim: The aim a dynamic study of the reproduction of SARS-CoV-2 virions and cytopathic effects on the Vero (E6) cell culture model after infection with Delta and Omicron strains.

Materials and methods: The study of ultrastructural changes was carried out on the Vero (E6) cell culture, into which the Delta and Omicron strains of SARS-CoV-2 were introduced. Infected cell cultures were fixed at three-time intervals: 6, 18 and 24 hours after virus inoculation.

Results: Most of the samples in both groups at the 6-hour stage had a similar morphological picture close to normal and were characterized by the formation of multiple transport vesicles. At the 18-hour stage, similar morphological features were revealed in the Delta and Omicron SARS-CoV-2 groups, such as vacuolization of the synthetic complex of EPS and CG, while the Omicron group was distinguished by altered mitochondrial morphology. Vivid destructive changes were detected at the 24-hour stage. Both groups were characterized by: hyaloplasm compaction, extensive vacuolization of organelles, as well as frequently occurring viral particles in vesicles. The dynamics of particle reproduction in each group revealed an increase in the quantitative indicator, starting at 18 hours and followed by a decrease in the level of virion replication by 24 hours.

Conclusion: Based on the study, it was suggested that there are similar mechanisms of development of Vero E6 cytopathic patterns caused by Delta and Omicron SARS-CoV-2 and active reproduction of virions in cell culture from 6 to 18 hours.

Full Text

Введение

При исследованиях патогенеза вирусов одним их основным вопросом является взаимодействие вирусной частицы с клетками инфицированного организма. В период Пандемии ультраструктурная визуализация этих взаимоотношений приобретает свою особую актуальность, так как она лежит в основе возникновения деструктивных изменений клеток организма инфицированного, влияющих на течение болезни. Эпидемия Covid-19, вызванная одним из штаммов SARS-CoV-2, в считанные месяцы переросла в пандемию и привела к беспрецедентным последствиям для здоровья населения. Она обратила внимание ученых, и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) на новый РНК-вирус, как серьезную медицинскую и социальную проблему [3;8].

Различия в строении геномов штаммов всех вирусов, в том числе и SARS-CoV-2, обуславливают разный уровень их инфекционных способностей и определяют особенности индуцированных ими структурных изменений на тканевом и клеточном уровне [9].

Ультраструктурные исследования взаимодействия вируса с клетками способствуют лучшему пониманию патологии респираторной системы, влекущих за собой тяжелое течение болезни и высокий уровень смертности пациентов [7].

Цель работы – исследование по ультраструктурной визуализации клеточной культуры Vero (E6) и репродукции вирионов в условиях инфицирования штаммами Delta и Omicron SARS-CoV-2 через 6, 18 и 24 ч после инокуляции.

Материалы и методы

Вирусы. Для ультраструктурного исследования были получены из Государственной коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор» штаммы вируса SARS-CoV - 2, циркулирующие на территории РФ hCoV–19/Russia/KHM-SRC-8583/2023 (Omicron, геновариант XBB), hCoV–19/Russia/Godara-delta-2804/2021 (Delta)

Клеточные культуры. В работе по исследованию цитопатических эффектов, вызываемых вирусом, применялась чувствительная к SARS-CoV - 2 перевиваемая культура клеток Vero (E6) (клетки почки зеленой мартышки), полученная из коллекции клеточных культур отдела «Коллекции микроорганизмов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор. Монослой клеточной культуры выращивался в 6-луночных планшетах с среде DMEM (ООО БиолоТ, Россия) по 1 мл в лунку с дополнительным использованием 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone, США) и  двух антибиотиков стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 МЕ/мл). Работа выполнялась при 37°С и в воздушной среде, содержащей 5% СО2. После формирования монослоя в каждую лунку вносили 0,2 мл среды с определенным штаммом SARS-CoV – 2. После завершения адсорбции вируса лунки промывали питательной средой с антибиотиками по 1 мл на лунку. Клетки инкубировали 2 сут при 37°С в воздушной среде, содержащей 5% СО2 [4].

Схема эксперимента. Для ультраструктурной визуализации деструктивных изменений клеточной культуры Vero (E6) в условии введения 0,1 MOI Delta или Omicron SARS-CoV-2 были созданы две группы.

Первая группа состояла из клеточных культур, инфицированных Delta–штаммом SARS-CoV-2. Фиксация проводилась в трех временных точках 6, 18 и 24 ч после инокуляции;

Вторая группа состояла из клеточных культур, инфицированных генетическим вариантом XBB Omicron–штамма SARS-CoV-2. Фиксация проводилась в трех временных точках 6, 18 и 24 ч после инокуляции;

 

Трансмиссионная электронная микроскопия

Для работы по визуализации морфологии ультратонких срезов клеточных культур, содержащих вирусы SARS-CoV-2, первоначально проводили окрашивание раствором уранилацетата и цитрата свинца (по Рейнольдсу). Получение изображения и обработка полученных снимков проводилась при помощи электронного микроскопа JEM-1400 (JEOL, Япония) и программного обеспечения iTEM (SIS, Германия).

Статистическая обработка. Обработка данных проводилась при помощи программы Microsoft Excel 2019. При анализе данных каждой группы, содержащей количественные переменные, были получены основные статистические показатели (среднее арифметическое, медиана, стандартное отклонение, стандартная ошибка среднего, квартили). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. При несоблюдении условий нормальности распределения и равенства дисперсии, сравнения групп проводили U-критерия Манна–Уитни и поправки Шидака. Во всех случаях различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при p<0,00511.

 

Результаты

Клеточная культура Vero (E6), инфицированная Delta SARS-CoV-2 на стадии 6, 18 и 24 ч

Ультраструктурная визуализация клеточных культур, инфицированных Delta-штаммом на стадиях 6, 18 и 24 ч после инокуляции, выявила ряд деструктивных изменений, характерных для каждого периода. Морфология большинства клеток группы на стадии 6 ч после инокуляции была в целом неизменной, хотя и определялось наличие адгезивных и инокулирующих вирионов вблизи плазмоллемы (рис. 1 А). В периферической части цитоплазмы некоторых клеток прослеживался везикулярный транспорт вирионов через мембрану (рис. 1 B). В отдельных образцах встречались клетки с деструктивными изменениями в аппарате Гольджи и митохондриях (рис. 1 B, C). На стадии 18 ч выявлялись отдельные клетки, содержащие множество вакуолей в цитоплазме (рис. 1 D). Особенностью группы выступали, связанные с мембранной везикулы реплицированных вирусных частиц (рис. 1 E). Количество вирионов, расположенных в межклеточном пространстве на стадии 18ч значительно отличалось от аналогичного значения на стадии 6 ч. Стадия 24 ч отличалась наличием в цитоплазме инфицированных клеток множественных везикул, содержащих реплицированные вирионы вируса (рис. 1 F).

Внутригрупповое исследование динамики количества вирионов на клетку показало, что для группы инфицирования Delta SARS-CoV-2 характерно статистически значимое возрастание количества вирусных частиц, на этапах 18 и 24 ч, значения p составляли 0,009 в обоих случаях (рис. 1G).

Рисунок 1. –Ультраструктурная визуализация изменений в инфицированной Delta-штаммом SARS-CoV-2 клеточной культуре Vero (E6) в трех промежуточных точках: 6, 18 и 24 ч после инокуляции. Электронограммы.

А – Область межклеточного пространства. Вирусные частицы SARS-CoV-2 в процессе адгезии (пунктирная стрелка) с элементами инокуляции (сплошная стрелка). Масштаб 500 нм.

B – Периферический участок цитоплазмы клетки. Крупные везикулы с включенными вирусными частицами SARS-CoV-2 (сплошная стрелка); справа – умеренно вакуолизированные структуры комплека Гольджи (КГ) (пунктирная стрелка). Я – ядро. Масштаб 500 нм.

C – Периферический участок цитоплазмы клетки. Митохондрии с просветленным и мелкозернистым матриксом (стрелки) и крупными везикулами  отдельных профилей эндоплазматической сети (В). Масштаб 500 нм.

D – Выраженная деструкция клетки в виде вакуолизация и уплотнения цитоплазматического матрикса (стрелка). Я – ядро. Масштаб 2 мкм.

E – Участок околоядерного пространства (Я). Упорядоченное скопление реплицированных вирионов,на внутренней поверхности мембран транспортных везикул (стрелки). Масштаб 500 нм.

F – Область цитоплазмы клетки Vero E6. Везикулы с реплицированными вирусными частицами SARS- CoV- 2 (стрелки). Масштаб 200 нм.

G – График, демонстрирующий динамику изменения количества вирусных частиц на клетку через 6, 18 и 24 ч после инокуляции Delta SARS-CoV-2.

 

Figure 1. Ultrastructural visualization of changes in Vero (E6) cell culture infected with Delta strain SARS-CoV-2 at three intermediate points: 6, 18 and 24 hours after inoculation. The electronograms.

A - The area of the intercellular space. SARS-CoV-2 virus particles in the process of adhesion (dotted arrow) to inoculation elements (solid arrow). The scale is 500 nm.

B - The peripheral part of the cytoplasm of the cell. Large vesicles with SARS-CoV-2 virus particles included (solid arrow); on the right, moderately vacuolized structures of the Golgi complex (KG) (dotted arrow). I am the core. The scale is 500 nm.

C - The peripheral part of the cytoplasm of the cell. Mitochondria with an illuminated and fine-grained matrix (arrows) and large vesicles of individual profiles of the endoplasmic reticulum (B). The scale is 500 nm.

D - Marked cell destruction in the form of vacuolization and densification of the cytoplasmic matrix (arrow). I am the core. The scale is 2 microns.

E - A section of the near-nuclear space(S). An ordered accumulation of replicated virions on the inner surface of transport vesicles membranes (arrows). The scale is 500 nm.

  1. F) The cytoplasm region of the Vero E6 cell. Vesicles with replicated SARS-CoV-2 virus particles (arrows). The scale is 200 nm.

G - A graph showing the dynamics of changes in the number of viral particles per cell 6, 18, and 24 hours after Delta SARS-CoV-2 inoculation.

 

Клеточная культура Vero (E6), инфицированная Omicron SARS-CoV-2 на стадии 6, 18 и 24 ч

Исследование клеточных культур, инфицированных через 6 ч XBB геновариантом Omicron-штаммом, продемонстрировало сходную морфологическую картину с группой Delta- штамма SARS-CoV-2. Так, в отдельных клетках выявлялись незначительные цитопатические изменения в форме просветления матрикса митохондрий (рис. 2 B) и расширения цистерн и пузырьков аппарата Гольджи, содержащих вирионы (рис. 2 C). Кроме того, стадия 6 ч характеризовалась наличием коронавирусных частиц в процессе адгезии вдоль клеточной мембраны (рис. 2 А). В группе  Omicron-штамма коронавируса на стадии 18 ч (рис. 2 D) наблюдались крупные транспортные везикулы с множественными вирионами SARS-CoV-2, аналогичные обнаруженным при заражении Delta SARS-CoV-2 в тот же срок. Митохондрии характеризовались неупорядоченным расположением мембранных крист и просветлением матриксного компартмента (рис. 2 E). Также, было установлено, что группа клеток стадии 24 ч имела более выраженные деструктивные изменения, чем на стадии 18 ч (рис. 2 F). Четко выявлялось «набухание» митохондрий вследствии чего, большинство из них имели просветленный матрикс (рис. 2 G). Визуально цитоплазма Vero E6 была значительно уплотнена, цитоплазматические органеллы характеризовались нечеткостью своих контуров.

Количество вирусных частиц на клетку в группе инфицирования Omicron SARS-CoV-2 было статистически значимо выше на этапах 18 и 24 ч по сравнению с 6 ч после инокуляции (p=0,0088 и 0,015 соответственно) (рис. 2 H).

 

Рисунок 2. – Ультраструктурные изменения в инфицированной Omicron SARS-CoV-2 клеточной культуре Vero (E6), в трех промежуточных точках: 6, 18 и 24 ч после инокуляции. Электронограмма.

А – Наружная клеточная мембрана с адгезированным вирионом (сплошная стрелка) и двумя профилями инокулирующих вирионов (пунктирные стрелки) SARS-CoV-2. Масштаб 200 нм.

B – Участок цтоплазмы клетки вблизи ядра с «набухшими» крупными митохондриями (стрелки). Я – ядро. Масштаб 1 мкм.

C – Фрагмент клетки с признаками высокой функциональной активности цитоплазматических органелл, отраженной в выраженной вакуолизации комплекса Гольджи (КГ). Отдельные мембранные элементы комплекса Гольджи демонстрируют новообразованные вирионы SARS-CoV-2 (стрелки). Масштаб 1 мкм.

D – Участок околоядерного пространства с крупными везикулами (стрелки), содержащими прикрепленные к мембране вирусные частицы SARS-CoV-2. Масштаб 500 нм.

E – Одна из клетки в состоянии деструкции. Выраженное набухание митохондрий (стрелки); на фоне оптически светлой гиалоплазмы наблюдаются фрагменты мембранных компонентов. Масштаб 1 мкм.

F – Две некротизированные клетки характеризуются высокой оптической плотностью цитоплазмы и крайней степенью вакуолизации органелл. Я – ядро. Масштаб 2 мкм.

G – Фрагмент цитоплазмы клетки с «набухшими» митохондриями (стрелки). Масштаб 1 мкм.

H – График, демонстрирующий динамику изменения количества вирусных частиц на клетку через 6, 18 и 24 ч после инокуляции Omicron SARS-CoV-2.

 

Figure 2. Ultrastructural changes in Omicron-infected SARS-CoV-2 Vero (E6) cell culture at three intermediate points: 6, 18, and 24 hours after inoculation. The electronogram.

A - An outer cell membrane with an adhered virion (solid arrow) and two profiles of inoculating virions (dotted arrows) of SARS-CoV-2. The scale is 200 nm.

B - A section of the cytoplasm of the cell near the nucleus with "swollen" large mitochondria (arrows). I am the core. The scale is 1 micron.

C _ A fragment of a cell with signs of high functional activity of cytoplasmic organelles, reflected in the pronounced vacuolization of the Golgi complex (KG). Individual membrane elements of the Golgi complex demonstrate newly formed SARS-CoV-2 virions (arrows). The scale is 1 micron.

D - A region of the near-nuclear space with large vesicles (arrows) containing SARS-CoV-2 virus particles attached to the membrane. The scale is 500 nm.

E - One of the cells is in a state of destruction. Pronounced swelling of mitochondria (arrows); fragments of membrane components are observed against the background of optically light hyaloplasm. The scale is 1 micron.

F - Two necrotic cells are characterized by a high optical density of the cytoplasm and an extreme degree of vacuolization of organelles. I am the core. The scale is 2 microns.

G - A fragment of the cytoplasm of a cell with "swollen" mitochondria (arrows). The scale is 1 micron.

H - A graph showing the dynamics of changes in the number of viral particles per cell 6, 18, and 24 hours after Omicron SARS-CoV-2 inoculation.

 

Обсуждение

Таким образом, в исследуемых группах прослеживались схожие тенденции во всех временных (6, 18 и 24 ч) точках. Взаимодействие вирусов с клетками начиная с инокуляции, репликации и до отпочкования приводило к усилению деструктивных изменений [5]. Основными цитопатическими эффектами были - вакуолизация синтетических аппаратов, уплотнение и просветление гиалоплазмы. Со временем увеличивалось и количество клеток в состоянии деструкции.

Формирование множественных везикул и адгезия вирионов вдоль плазмолеммы были характерны для клеток спустя 6 ч после инокуляции, что согласуется с результатами других исследований [1, 6]. В случае Omicron SARS-CoV-2 аппарат Гольджи был изменен и содержал новообразованные вирусные частицы.

На этапе 18 ч после инокуляции обе группы характеризовались вакуолизацией синтетического аппарата клеток (ЭПР, комплекса Гольджи). При этом в цитоплазме некоторых клеток, инфицированных Delta-штаммов, были обнаружены везикулы с новообразованными вирусными частицами. Omicron-штамм отличился морфологическим изменением митохондрий.

Через 24 ч после инокуляции в каждой исследуемой группе были обнаружены вирусные частицы в составе транспортных везикул. Деструктивные изменения выявлялись часто и были выражены – отмечено просветление и вакуолизация органелл, значительное уплотнение гиалоплазмы. В соответствии с литературными данными такой временной промежуток является достаточным для интенсификации цитопатических изменений [1].

Группы Delta и Omicron SARS-CoV-2 значительно не отличались по интенсивности деструктивных изменений в клеточной культуре Vero (E6), однако были выявлены паттерны некоторых деструктивов, специфичных для Omicron-штамма SARS-CoV-2 (двумембранные везикулы, образованные цистернами грЭПР).

Количество вирусных частиц на клетку при инфицировании Delta-штаммом SARS-CoV-2 за второй промежуток времени прошедших с момента инфицирования (с 6 до 18 часов) увеличилось примерно в 4 раза, а при инфицировании Omicron SARS-CoV-2 увеличилось примерно в 3,5 раза. За следующие 6 часов (с 18 по 24 часов) количество вирусных частиц Delta-штамма и Omicron SARS-CoV-2 на клетку не изменилось.

Количество вирусных частиц на клетку при заражении Delta-штаммом SARS-CoV-2 за первые 6 ч, прошедших с момента инфицирования меньше примерно на 25%, чем при Omicron SARS-CoV-2. При заражении Delta-штаммом SARS-CoV-2 в момент времени соответствующий 18 ч после инфицирования меньше примерно на 28,5%, чем при Omicron SARS-CoV-2.

 

Заключение

Ультраструктурное исследование цитопатических эффектов инфицированной Delta и Omicron штаммами SARS - CoV-2 клеточной культуры Vero (E6), в динамике 6, 18 и 24 ч после инокуляции, продемонстрировало, схожие деструктивных паттерны в обеих группах. Общими чертами на 6 ч стадии были множественные адгезивные и инокулирующие вирусные частицы в близи мембран и формирование транспортных везикул, активная везикуляция клеток, в том числе синтетического аппарата и деструктивные изменения в виже измененного матрикса митохондрий на стадиях 18 и 24 ч. Также проводился подсчет репродукции вирусных частиц SARS-CoV-2, с последующим сравнительным статистическим анализом в инфицированных клетках для исследования зависимости количества вирусных частиц на степень развития цитопатических изменений.

При исследовании динамики количества вирионов внутри групп было выявлено, что в обеих группах количество вирусных частиц на клетку статистически значимо возрастает на этапе 18 ч по сравнению с 6 ч (p=0,009 для Delta SARS-CoV-2; p=0,0088 для Omicron SARS-CoV-2). На момент 24 ч количество вирионов оставалось неизменным по сравнению с 18 ч.

×

About the authors

Ekaterina Viktorovna Spiridonova

ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Email: spiridonova_ev@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0009-0006-8655-6713
Russian Federation, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector". Novosibirsk Region, Koltsovo, Russia. 630559.

Ksenia Fedorovna Emtsova

ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Email: emtsova_kf@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0009-0003-5165-5357
Russian Federation, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector". Novosibirsk Region, Koltsovo, Russia. 630559.

Vladimir Vilorievich Omigov

ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Email: omigov_vv@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-2028-6099

к.м.н.

Russian Federation, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector". Novosibirsk Region, Koltsovo, Russia. 630559.

Oleg Svyatoslavovich Taranov

ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Email: taranov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6746-8092
Russian Federation, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector". Novosibirsk region, Koltsovo, Russia. 630559.

Anastasia Alekseevna Moiseeva

ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Email: chalaya_aa@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7048-2357

Junior Researcher

Russian Federation, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector". Novosibirsk Region, Koltsovo, Russia. 630559.

Elena Igorevna Danilenko

ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Author for correspondence.
Email: danilenko_ei@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0009-0007-8106-7037

Junior Researcher

Russian Federation, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector". Novosibirsk region, Koltsovo, Russia. 630559.

References

  1. Ayari A., Rosa-Calatrava M., Lancel S. et al. Influenza infection rewires energy metabolism and induces browning features in adipose cells and tissues. Commun. Biol. 2020. 3, 237. https://doi.org/10.1038/s42003-020-0965-6.
  2. Babkin I.V., Tyumentsev A.I., Tikunov A.Y., Kurilshikov A.M., Ryabchikova E.I., Zhirakovskaya E.V., Netesov S.V., Tikunova N.V. Evolutionary time-scale of primate bocaviruses. Infect. Genet. Evol. 2013; 14:265-274. doi: 10.1016/j.meegid.2012.12.023.
  3. Bevova M.R., Netesov S.V., Aulchenko Y.S. The New Coronavirus COVID-19 Infection. Mol. Gen. Microbiol. Virol. 2020; 35(2):53-60. doi: 10.3103/S0891416820020044.
  4. Bourgonje A.R., Abdulle A.E., Timens W., Hillebrands J.L., Navis G.J., Gordijn S.J., Bolling M.C., Dijkstra G., Voors A.A., Osterhaus A.D., van der Voort P.H., Mulder D.J., van Goor H.J. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease 2019 (COVID-19). 2020; doi: 10.1002/path.5471.
  5. Cao Y.C., Deng Q.X., Dai S.X. Remdesivir for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 causing COVID-19: an evaluation of the evidence. Travel Med. Infect. Dis. 2020; 35:101647. doi: 10.1016/j.tmaid.2020.101647.
  6. Eymieux S., Rouille Y., Terrier O. et al. Ultrastructural modifications induced by SARS-CoV-2 in Vero cells: a kinetic analysis of viral factory formation, viral particle morphogenesis and virion release. Cell. Mol. Life. Sci. 2021; 78(7):3565-3576. doi: 10.1007/s00018-020-03745-y.
  7. Gong Y., Qin S., Dai L., Tien Z. Glycosylation of SARS-CoV-2 and its receptor ACE2. Signal transductive target Ther. 2021; 6 (1): 396. doi: 10.1038 / s41392-021-00809-8.
  8. Jackson C.B., Farzan M., Chen B., Choe H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.Nat Rev Mol Cell Biol. 2022 Jan;23(1):3-20. doi: 10.1038/s41580-021-00418-x.
  9. Singh S. A., Pritam M., Pandey B., Yadav T.P. Microstructure, pathophysiology, and potential therapeutics of COVID-19: A comprehensive review. J. Med. Virol. 2021; 93(1):275-299.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Eco-Vector


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.