The use of L-dopa induces the resistance of Mauthner's neurons to the neurotoxic action of beta-amyloid



Cite item

Abstract

Objective - to study the three-dimensional structure of Mauthner neurons in goldfish and the ultrastructure of their afferent synapses under the influence of L-dopa and the toxic fragment of 25-35 beta-amyloid.Materials and methods. The study was performed on Mauthner neurons of the goldfish fry (n=12) by the methods of light and electron microscopy. The identification of Mauthner's neurons and the reconstruction of their integral structure, the determination of the volume of the soma, ventral and lateral dendrites and the study of the structure of afferent synapses were carried out using serial sections 3 μm thick.Results. The use of L-dopa stabilizes the size of the soma and ventral dendrites. A decrease in the volume of the lateral dendrite is accompanied either by an increase in the volume of its branches under the action of beta-amyloid, then L-dopa, or an increase in the volume of medial dendrites under the action of L-dopa, then beta-amyloid. Pathological changes in the ultrastructure of neurons and afferent synapses were not found, but signs of early amyloidosis were revealed.Conclusions. The use of L-dopa slows down the degeneration of Mauthner's neurons. It has been suggested that the resistance of whole neurons to the neurotoxic action of beta-amyloid is due to the mechanism of structural homeostasis aimed at compensatory restoration of the morphological organization of neurons.

Full Text

Отростки клеточных тел нейронов, дендриты, выполняют ключевые функции в интеграции сигналов, поступающих к нейрону, в формировании и поддержании сетевых взаимодействий, в обеспечении синаптической пластичности. Дендриты являются наиболее лабильными отделами нейронов. Их морфология существенно изменяется при специфической стимуляции и деафферентации [1], в процессе развития эволюционных механизмов [2], при патологических мозговых нарушениях [3]. Дендриты первыми подвергаются локальной деструкции и дегенерации в условиях токсического воздействия бета-амилоида. При болезни Альцгеймера и моделировании этого заболевания, дендриты огибают в ткани мозга плотные отложения, состоящие преимущественно из бета-амилоида, гистопатологического индикатора болезни, меняют траекторию, истончаются, утрачивают ветвления и синапсы [3]. Проведение экспериментов на инъекционных моделях амилоидоза показывает, что эти отростки могут быть хорошими объектами для изучения путей влияния на характер деструктивного процесса, его обострение, замедление или предотвращение. Так, применение одного бета-амилоида приводит к уменьшению диаметра и длины идентифицированных дендритов маутнеровских нейронов (МН) золотой рыбки [4]. Сочетание воздействия бета-амилоида и длительной вестибулярной или оптокинетической стимуляции, влияющей на входы к МН через латеральный дендрит (ЛД) и вентральный дендрит (ВД) вызывает сильную дистрофию дендритов, сопровождаемую патологическими изменениями образованных ими синапсов [5]. В коре млекопитающих дегенеративные изменения дендритов и синапсов являются следствием вызванного бета амилоидом снижения уровня дофамина, прямо влияющего на механизмы синаптической передачи [6]. Известно, что дофамин модулирует электрическую и химическую передачу в смешанных синапсах МН, образованных окончаниями волокон VIII нерва и реакцию избегания золотой рыбки через клеточные механизмы цепи МН [7]. Аппликации дофамина в область МН не только стабилизируют размеры нейронов и вызывают их устойчивость к эффектам длительной стимуляции [8], но и при совместном действии бета-амилоида и стимуляции - снижают степень дегенерации дендритов и существенно сохраняют ультраструктуру аксо-дендритных синапсов [9]. Однако на практике увеличение дофамина в мозге достигается стимуляцией дофаминергической передачи с помощью предшественника дофамина, L-3,4-дигидроксифенилаланина (L-дофа), преодолевающего гематоэнцефалический барьер [10]. Механизм действия дофамина и L-дофа одинаков и связан с разрушением фибрилл бета-амилоида [11]. Принимая во внимание тот факт, что увеличение уровня дофамина в мозге оказывает антиамилоидогенное действие [6], а в геометрии дендритов заложен патоморфологический механизм нейродегенерации [12], целесообразно применить L-дофа в качестве средства, способствующего сохранению нормальной структуры дендритов и аксо-дендритных синапсов.

Цель настоящей работы – исследовать трехмерное строение МН золотой рыбки и ультраструктуру их афферентных синапсов при воздействии L-дофа и токсического фрагмента 25-35 бета-амилоида (далее бета-амилоид).

Материал и методы

Исследование выполнено на аутопсийном материале 12 мальков золотой рыбки

(Carassius auratus L.) породы «Оранда», 3 мес возраста, длиной около 3.5см, массой около 2г. Эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно Хельсинской декларации 1975, 2000 гг. На проведение исследования было получено разрешение комиссии по биологической безопасности и биоэтике ИТЭБ РАН (№7 от 05.03.2019 г.). Агрегирование бета-амилоид (Sigma, США), его инъекции в объеме 4 мкл в область расположения МН выполняли, как описано ранее [4]. Для медикаментозного повышения уровня дофамина рыбку помещали в 200 мл раствора L-дофа в концентрации 20 мг/мл (Леводопа, Torrent Pharmaceutical, Индия), полагая, что препарат через жабры проникает в кровь и попадает в мозг. Ранее нами были изучены качественные и количественные характеристики морфофункциональных состояний МН рыбок, подвергнутых раздельно действию этого фрагмента бета-амилоида и соответствующих контролей [4, 13]. В настоящей работе мы сосредоточились на двух вариантах сочетания воздействий бета-амилоида и L-дофа. Рыбок делили на три группы: интактную группу и две подопытные группы. Рыбкам подопытной группы 1 апплицировали бета-амилоид, спустя 1час помещали на 5 час в раствор L-дофа, фрагментирующего лентовидные фибриллы бета амилоида, согласно установленному in vitro механизму действия [11], затем рыбок переносили в аквариумную воду, фиксацию проводили через 1час. Рыбок подопытной группы 2 выдерживали 5 час в растворе L-дофа, аппликацию бета-амилоида выполняли через 20 час, считая, что накопление дофамина в мозге с помощью L-дофа, стабилизирует актиновый цитоскелет, с которым связана устойчивость структуры МН к повреждающим воздействиям [8], фиксацию проводили через 5 час. В качестве анестезии до аппликации бета-амилоида рыбок помещали в ледяную воду до состояния неподвижности. Для морфологического исследования у мальков извлекали продолговатый мозг, отсекали участок, содержащий МН, фиксацию и обработку материала проводили по стандартной электронно-микроскопической методике, принятой в лаборатории [4, 14]. МН являются двумя уникальными гигантскими клетками ретикулярной формации, сома и дендриты которых занимают значительный объем продолговатого мозга, а миелинизированные аксоны следуют до кончика хвоста рыбки. От тела клетки ЛД направляется преимущественно в латеральном направлении, а ВД – в вентро-ростральном. Такая траектория дендритов не позволяет их охарактеризовать достаточно полно с помощью традиционного метода световой микроскопии. С помощью пирамитома LKB (Швеция) были изготовлены серийные поперечные срезы толщиной 3 мкм и по тем из них, которые содержали МН (примерно 90-100 срезов), были воссозданы целостные нейроны в виде их виртуальных изображений, дополненных размерами отделов нейрона [14]. Ультратонкие срезы получали на ультратоме Leica EM UC6 (Австрия) из переклеенных на новые эпоновые блоки отобранных гистологических срезов отделов МН. Контрастировали срезы уранилацететом и цитратом свинца, изучали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония) при увеличении 17000 в Объединенном Пущинском центре электронной микроскопии. На оцифрованных негативах аксонных окончаний, контактирующих с проксимальными отделами дендритов МН, в программе Image Tool, проводили морфометрические измерения длин специализированных синаптических химических (активных зон) и электрических (щелевых) контактов, а также соседствующих с ними десмосомоподобных контактов, в состав которых входит филаментозный актин [5, 9]. Статистическую обработку размеров отделов МН проводили с использованием программы SigmaPlot 11.0, Systat Software, Inc., 2008. Значимость различий оценивали с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса с попарным сравнением по критерию Тьюки. Статистически значимыми считали различия при р <0.05. Результаты представлены в таблицах в виде среднего арифметического значения ± ошибка среднего. Статистическую обработку длин контактов выполняли в программе Microsoft Office Excel 2003. Значимость различий между группами оценивали по величине t критерия Стьюдента.

Результаты исследования

            Изображение интегрального строения МН интактных и подопытных золотых рыбок представлено на рис. 1. Нейроны интактных рыбок характеризуются хорошо развитыми основными дендритами (рис. 1, а), и ничем существенным не отличаются от других интактных нейронов, исследованных нами ранее [4, 5]. При визуальном изучении не выявлено патологических изменений формы, строения, размеров соматических отделов, ЛД и ВД опытных МН по сравнению с интактными нейронами. ВД и ЛД опытных нейронов также сохраняют концевые ветвления (рис.1, б, в). Однако, у МН, принадлежащих к группе 2 с вентральной стороны клеточного тела заметно увеличение количества коротких медиальных дендритов. Результаты морфометрических измерений приведены в таблице 1. Сравнение нейронов по величине отделов выявляет однотипные и специфические изменения, характерные для нейронов экспериментальных групп. Так, не обнаружено различий между значениями объема сомы и ВД опытных и интактных МН, за исключением уменьшения длины ствола ВД МН из группы 2. Значения объема и длины ствола ЛД в обеих опытных группах достоверно меньше интактных значений, что может указывать на то, что деструктивный процесс начинается с уменьшения длины (не толщины) дендритов. Измерения выявили особенности морфологии МН, обусловленные очередностью в использовании бета-амилоида и L-дофа. Применение L-дофа после бета-амилоида оказалось более эффективным. Объем ЛД и его ветвей был существенно больше в группе 1, чем в группе 2. Однако в группе 2 почти в 2 раза возрастал суммарный объем медиальных дендритов по сравнению с величиной медиальных дендритов группы 1 (и в 3 раза по сравнению с интактной группой). Мы оценили интегральные объемы МН в группах. Исходя из табличных значений суммарные объемы отделов МН, ветвей и медиальных дендритов, имели достаточно близкие значения в интактной группе, группе 1 и группе 2: 253,4; 248,8; 245,1; соответственно.

Электронно-микроскопическое изучение соматической части опытных МН не выявило изменений в строении ядра и ядрышка, которые отличали бы их друг от друга и от строения интактных МН. Ядра светлые, гетерохроматин в виде небольших глыбок равномерно распределен в гомогенной кариоплазме (рис. 2, а, б). Ядрышки сферической формы, крупные, электронно-плотные, локально видна их фибриллярная структура. Комплекс Гольджи слабо гипертрофирован. Гладкий эндоплазматический ретикулум представлен многочисленными вакуолями. Как и у интактных МН, крупные и среднего размера округлой формы митохондрии выглядят слегка набухшими. У части из них кристы отсутствуют или их остатки смещены к наружной мембране органеллы, а центр содержит вакуоль. У небольших митохондрий отмечена локальная инвагинация мембран в полость органеллы. В цитоплазме присутствуют фагосомы (рис. 2, в) и остаточные тельца. Изменений в структуре цитоскелета, его составе и взаиморасположении элементов опытных МН по сравнению с интактными не обнаружено. Миелиноподобные образования встречаются редко и только в постсинаптической цитоплазме. Строение аксо-дендритных синапсов характеризуется некоторыми особенностями в подопытных группах. Бутоновидные окончания, образующие контакты химического типа с МН группы 1 отличаются от интактных окончаний только тем, что в ряде бутонов синаптические везикулы агрегируются в группки или цепочки (рис. 2, в). Такого типа окончания в группе 2, выглядит иначе. Некоторые бутоны отделяются узкими цитоплазматическими выростами МН, при этом везикулы сосредоточены у активной зоны, с неопределяемыми контурами пре- и постсинаптических мембран (рис. 2, г). Встречаются также бутоны, в которых везикулы изолированы двойным мембранным контуром. Подобные вдавливания одного аксонного окончания в другое, могут быть вызваны травмирующим действием жестких амилоидных фибрилл, обволакивающих нейроны и нарушающих характерное для МН кластерное расположение бутонов. Однако дегенерирующие по темному типу окончания c повышенной осмиофильностью структур не обнаружены. Появляются, но крайне редко, опустошенные синапсы обычного размера, в центре которых либо локализуется крупная вакуоль, либо они заполняются гетерогенными по форме и размерам вакуолями.

Значительная часть булавовидных окончаний, образующих электрический контакт с поверхностью МН из группы 1 содержит набухшие митохондрии и поврежденные кристы (рис.2, д). Таких изменений митохондрий в подобных синапсах группы 2 нет. Однако в постсинаптической зоне обнаружено не характерное отгораживание элементов цитоскелета цистернами продольного ретикулума (рис. 2, е). Анализ морфометрических измерений не выявил различий в длинах специализированных синаптических контактов.

Обсуждение полученных данных

Проведено исследование влияния L-дофа на МН, подвергнутые действию токсического фрагмента бета-амилоида. Ключевым является ответ на вопрос, сможет ли применение этого средства влиять на деструктивный процесс и сохранить структуру нейронов, близкую к интактной. Показано, что сома и ВД проявляют устойчивость к нейротоксическому действию бета-амилоида, поскольку объемы этих отделов не изменились. Разной степени уязвимость проявляют ЛД. В условиях применения L-дофа после бета-амилоида, благодаря разрушающему миелоидные фибриллы эффекту L-дофа [11], ЛД группы 1 оказались более устойчивыми, чем ЛД группы 2. Важно отметить, что изменения морфологии ЛД в группах сопровождаются разными компенсаторными реакциями. В группе 1, возрастает объем ветвей дендритов за счет смещения точки бифуркации и дихотомического ветвления, что приводит к увеличению воспринимающей поверхности ЛД. В группе 2, при воздействии L-дофа до применения бета-амилоида объем ЛД уменьшается существеннее, однако этот эффект нивелируется ростом медиальных дендритов, что тоже увеличивает поверхность МН. О феномене гипертрофии одиночных медиальных дендритов при глубокой дегенерации клеточных тел и основных дендритов МН, сообщалось нами ранее [5]. Считается, что строение дендритов предопределено генетически и поддерживается внутренним гомеостазом, одной из характеристик которого могут быть показатели дендритных измерений [15]. В регуляцию размеров дендритов вовлечены внешние и внутренние факторы для нейрона, такие как химические и электрические сигналы от входящих волокон, баланс медиаторных систем, адаптивные и другие влияния. Анализируя полученные нами данные измерений в совокупности и, учитывая достаточно близкие значения интегральных объемов МН в интактной и подопытных группах, можно признать, что с помощью L-дофа целостные МН проявляют морфологическую устойчивость к действию бета-амилоида. Такая стабильность, по нашему мнению, обусловлена влиянием механизма структурного гомеостаза, направленного на компенсаторное восстановление морфологической организации МН.

Исследование ультраструктуры МН подопытных групп не выявило изменений деструктивного характера в строении ядерного аппарата, элементов цитоскелета большинства органелл и специализированных синаптических контактов. Гипертрофия комплекса Гольджи и гладкого эндоплазматического ретикулума, набухание митохондрий могли бы быть реакцией нейронов на повреждение. Однако появление миелиновых структур, фагосом, деструкция части пула митохондрий свидетельствуют о начале патологического процесса. Такие изменения не отражаются на объеме соматических отделов, находящихся под контролем актинового цитоскелета, элементы которого еще не затронуты. На признаки амилоидоза также может указывать ультраструктура афферентных синапсов. Образование инвагинированных аксонных окончаний, агглютинация синаптических везикул, изменение митохондрий свидетельствуют о дефиците синаптических и митохондриальных процессов. Представленный в работе анализ ультраструктуры МН при действии L-дофа и бета-амилоида, существенно отличается от ультраструктурных последствий аппликации одного бета-амилоида, включающих нарушение контура плазматической мембраны, деструкцию цитоскелета, вакуолизацию цитоплазмы, изменение формы и содержимого митохондрий, опустошение везикулярного аппарата афферентных синапсов [16].

Заключение

Применение L-дофа замедляет дегенерацию дендритов МН золотой рыбки.

Предполагается, что устойчивость МН к действию бета-амилоида обеспечивается компенсаторными изменениями и регулируется клеточным гомеостатическим механизмом. В условиях действия гомеостатического механизма электронно-микроскопически выявляются только ранние признаки амилоидоза, прогрессирование которого, очевидно, приведет к разрушению этого механизма и к несбалансированным реакциям.

Тем не менее, исследования нейроморфологических процессов при моделировании амилоидоза и путей воздействия на него, остаются актуальными.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Виртуальные изображения интегрального строения МН золотой рыбки.

а – нейроны интактной золотой рыбки; б – аппликация бета-амилоида и воздействиее L-дофа; в – воздействие L-дофа и аппликация бета-амилоида. Фиксация: глутар-осмий, заключение в эпон. С – сома клетки; ЛД, ВД, – латеральный и вентральный дендрит, соответственно; МД - медиальные дендриты, АКС - аксон.

Рис. 2. Ультраструктура МН и их афферентных синапсов.

а, в, д – при аппликации бета-амилоида и воздействии L-дофа; б, г, е - при воздействии L-дофа и аппликации бета-амилоида. Фиксация: глутар-осмий, заключение в эпон. Я – ядро; Яд – ядрышко; КГ – комплекс Гольджи; АО – аксонное окончание, М – митохондрия, СВ - синаптические везикулы, ЦВ – цитоплазматический вырост; ЭПР - эндоплазматический ретикулум; АЗ – активная зона, ЩК – щелевой контакт, ДК – десмосомоподобный контакт.

Таблица 1. Результаты морфометрических измерений. Представлены объемы (103 мкм3) и длины (мкм) отделов МН интактных и подопытных золотых рыбок (M±m)

 

Сома

Латеральный дендрит

Вентральный дендрит

Медиальные дендриты

Объем

Объем

ствола

 

Объем ветвей

Длина

ствола

 

Объем

ствола

 

Объем ветвей

длина

ствола

 

Суммарный объем

 

 

Интактная группа (n=8)

 

127±6,7

49,5±4,2

16±1,7

139±4,3

43±4,1

10,2±1,4

202±9,4

7,1±1,2

 

 

Подопытная группа 1: бета-амилоид + L-дофа (n=8)

 

121±3,3

36±1,4*

 

30±3,6**

96±4,8**

31±4,1

 

16±5,6

 

190±10

14,5±2,1

 

 

Подопытная группа 2: L-дофа + бета-амилоид (n=8)

 

129±7,3

28,8±1,6**,♯♯

 

14,5±11,5♯♯

80,9±4,8**

 

34,4±3,8

14,5±3.1

173±3*

 

 

23,7±3**,

 

Примечание.  n – количество исследованных нейронов;

* p<0.05; ** p<0.01 - по сравнению с интактными МН; p <0.05, ♯♯ p <0.01 – по сравнению с МН группы 1.

×

About the authors

Nadezhda Romanovna Tiras

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Author for correspondence.
Email: ntiras@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-2624-8816
SPIN-code: 5775-3123
Scopus Author ID: 7004174890
ResearcherId: B-3130-2014

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

лаборатории экспериментальной нейробиологии

Russian Federation, 142290, Россия, Пущино, Институтская ул. д.3

Irina Mikheeva

Email: mikheirina@yandex.ru
Russian Federation

Gulnara Mihailova

Email: mihailova_g@rambler.ru

Nadezhda Aleksandrovna Penkova

Email: kokanchik@rambler.ru

Sergey Surenovich Khutzian

Email: khutzian@yandex.ru

References

  1. Moshkov D.A., Mikhailova G.Z., Grigorieva E.E., et al. Role of different dendrites in the functional activity of the central neuron controlling goldfish behavior // J. Integr. Neurosci. 2009. Vol. 8, N. 4. P. 441-451. doi: 10.1142/s02196352090002307.
  2. Tanvir Z., Rivera D., Severi K.E., et al. Evolutionary and homeostatic changes in morphology of visual dendrites of Mauthner cells in Astyanax blind cavefish // J. Comp. Neurol. 2021. Vol. 529, N. 8. P. 1779–1786. doi: 10.1002/cne.25056.
  3. Vickers J.C., Mitew S., Woodhouse A., et al. Defining the earliest pathological changes of Alzheimer’s disease // Curr. Alzheimer Res. 2016. Vol. 13, N. 3. Р. 281-287. doi: 10.2174/1567205013666151218150322.
  4. Kokanova N.A., Mikhailova G.Z., Shtanchaev R.Sh., et al. Morphofunctional changes in goldfish mauthner neurons after application of βamyloid // Neurosci. Behav. Phisiol. 2010. Vol. 40, N. 8. P. 858-862. doi: 10.1007/s11055-010-934-1.
  5. Tiras N.R., Mikheeva I.B., Mikhailova G.Z., et al. Compensatory changes in Mauthner neurons in goldfish induced by sensory stimulation and application of β-amyloid // Neurosci. Behav. Physiol. 2019. Vol. 49, N. 6. P. 784-790. doi: 10.1007/s11055-019-00802-3.
  6. Moreno-Castilla P., Rodrigues-Duran L., Guzman-Ramos K., et al. Dopaminergic neurotransmission dysfunction induced by amyloid-β transforms cortical long-term potentiation into long-term depression and produces memory impairment // Neurobiol. Aging. 2016. Vol. 41, P. 187-199. doi: 1016/j.neurobiolaging.2016.02.021.
  7. Medan V., Preuss T. The Mauthner cell circuit of fish as a model system for startle plasticity // J. Physiol. Paris. 2014. Vol. 108, N. 2-3. P. 129-140. doi: 10.116/j.jphysparis.2014.07.006.
  8. Moshkov D.A., Pavlik L.L., Shubina V.S., et al. Cytoskeletal regulation of the cellular function by dopamine // Biophysics. 2010. Vol. 55, N. 5. P. 750-755. doi: 10.1134/s0006350910050118.
  9. Tiras N.R., Mikheeva I.B., Mikhailova N.A., et al. Dopamine enhances the resistance of dendrites of Mauther neurons to destruction induced by sensory stimulation and the application of beta-amyloid // Bull. Exp. Biol. Med. 2020. Vol. 169, N. 2. P. 266-269. doi: 10.1007/s10517-020-04865-y.
  10. Ambrée O., Richter H., Sachser N., et al. Levodopa ameliorates learning and memory deficits in a murine model of Alzheimer’s disease // Neurobiol. Aging. 2009. Vol. 30, N. 8. P. 1192–1204. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2007.11.010.
  11. Li J., Zhu M., Manning-Bog A.B., et al. Dopamine and L-dopa disaggregate amyloid fibrils: implications for Parkinson's and Alzheimer's disease // FASEB J. 2004. Vol. 18, N. 9. P. 962-964. doi: 10.1096/fj.03-0770fje.
  12. Cochran J.N., Hall A.M, Roberson E.D. The dendritic hypothesis for Alzheimer’s disease pathophysiology // Brain Res. Bull. 2014. Vol. 103, P. 18–28. doi: 10.1016/j.brainresbull.2013.12.004.
  13. Kokanova N.A., Mikhailova G.Z., Shtanchaev R.Sh., et al. Induction of neuron morphological resistance to βamyloid // Neurosci. Behav. Phisiol. 2013. Vol. 43, N.1. P. 17-27. doi: 10.1007/s11055-012-9685-9.
  14. Михайлова Г.З., Коканова Н.А., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Трехмерная реконструкция и определение объема нейрона. Москва: Либроком, 2012. 80с.
  15. Samsonovich A.V., Ascoli G.A. Morphological homeostasis in cortical dendrites // Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 2006. Vol. 103, N. 5. P. 1569–1574. doi: 10.1073/pnas.0510057103.
  16. Kokanova N.A., Mikhailova G. Z., Shtanchayev R. Sh., et al. Morphofunctional and ultrastructural consequences of application of beta-Amyloid on goldfish Mauthner
  17. neurons // Neurophysiology. 2014. Vol. 46, N. 1. P. 33-42. doi: 10.1007/s11062-014-9403-z.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Tiras N.R., Mikheeva I., Mihailova G., Penkova N.A., Khutzian S.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 0110212 от 08.02.1993.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies