STRUCTURAL REORGANIZATION OF THE DERMIS OF DOG TIBIA DURING ITS ELONGATION BY THE METHOD OF TRANSOSSEOUS DISTRACTION OSTEOSYNTHESIS

Full Text

При удлинении конечности методом чрескостного дистракционного остеосинтеза (ЧДО) состояние параоссальных тканей играет важную роль. В связи с этим в последние годы в Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова особое внимание уделяется изучению мягкотканевого компонента, в том числе и кожи. Исследования акустических свойств кожного покрова пациентов с патологией различных сегментов конечностей в разные периоды лечения методом ЧДО выявили повышение коэффициента анизотропии, связанное с возрастанием скорости звука в коже, в направлении, совпадающем с вектором ее растяжения [10]. Согласно результатам гистологических исследований дозированно растянутого кожного покрова, существует его связь со структурной перестройкой фибриллярного остова дермы [3]. При реконструктивных операциях на кисти в условиях ЧДО прослежена общая тенденция к активному росту и утолщению пролиферирующих слоев эпидермиса и восстановлению нормального строения дермы [5]. Исследование содержания и распределения различных классов гликозаминогликанов (ГАГ) в тканях кожного покрова голени, удлиняемой по методу Г. А. Илизарова, показало, что пик накопления в дерме сульфатированных и несульфатированных ГАГ приходился на период фиксации, что свидетельствует об активном процессе фибриллогенеза и начале перестроечных процессов в волокнистом остове кожи [4]. Однако комплексного исследования состояния кожного покрова на разных структурных уровнях в условиях ЧДО с позиций современной гистологии [6] ранее не проводилось. Цель данного исследования - изучить особенности строения дермы кожного покрова голени у собаки на этапах ЧДО. Материал и методы. Исследована кожа передней поверхности голени 16 взрослых беспородных собак, которым через 5 сут после флексионной остеоклазии берцовых костей осуществляли удлинение голени с суточным темпом 1 мм за 4 приема. Величина удлинения голени составляла 17,6±0,4%. Животных выводили из опыта через 28 сут дистракции, 30 сут фиксации и через 30 сут после снятия аппарата. Уход, оперативные вмешательства, эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». В качестве контроля исследовали кожный покров 6 интактных собак. Часть материала фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином - эозином, по Ван-Гизону, орсеином по Тенцеру-Унну. Пролиферативную активность клеток оценивали на парафиновых срезах путем выявления антигена Ki67 стрептавидин-биотиновым методом (протокол и реактивы фирмы Novocastra, Великобритания). Другую часть фрагментов кожи фиксировали в смеси аль-вый и сетчатый слои. В сосочковом слое наблю дегидных фиксаторов, дегидратировали и заливали в аралдит. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим с постановкой ШИК-реакции. Оцифровку изображений выполняли на аппартно-программном комплексе ДиаМорф (Россия). Измерение толщины дермы, площади клеток фибробластического дифферона, их ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) осуществляли при помощи программы-анализатора изображений ВидеоТесТ-Морфология 4.0 (Россия). В выборке измерений не менее 300 клеток определяли соотношение клеток с различной площадью и ЯЦО. Численную плотность клеток дермы рассчитывали на 1 мм2, предварительно подсчитывая количество клеток в поле зрения микроскопа при общем увеличении 640. Статистическую обработку данных выполняли с использованием компьютерной программы AtteStat [2]. Нормальность распределения определяли, используя критерии типа Колмагорова и Смирнова, а также критерий Шапиро-Уилка. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента для независимых выборок и считали значимыми при Р<0,05. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB Bromma Ultratome Nova (LKB, Швеция), контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по E. S. Reynolds [13]. После этого материал изучали при помощи трансмиссионного электронного микроскопа JEM-7А (Jeol, Япония), архитектонику волокнистого остова дермы - с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Jeol, Япония). Результаты исследования. Через 28 сут дистракции в дерме различались сосочкодалась активная макрофагальная реакция, менее выраженная в сетчатом слое кожи. Вблизи микрососудов были отмечены скопления тучных клеток. В сосочковом и наружной части сетчатого слоев дермы наблюдалось значительное количество микрососудов, преимущественно капиллярного типа. Коллагеновые волокна имели более плотное, чем в контроле, расположение и были направлены вдоль вектора растяжения (рис. 1, а). Наряду с крупными пучками волокон, определялись более тонкие сетчатые структуры и микрофибриллярный компонент, обнаруживающийся вокруг фибробластов. В сетчатом слое дермы эластические волокна имели плоскую и цилиндрическую форму и были более короткими и утолщенными, чем в контроле. В сосочковом слое имелись тонкие разветвленные эластические волокна, формирующие нежные сетчатые структуры. Толщина дермы на уровне сосочков и между ними по сравнению с контролем уменьшалась на 5 и 6,8% соответственно (таблица). К окончанию периода дистракции в дерме отмечалось значимое повышение численной плотности всех типов встречаемых в ней клеток, за исключением фиброцитов. Численная плотность фибробластов превышала показатели контроля в 9,4 раза, периваскулярных клеток - в 3 раза, клеток макрофагального ряда - в 5,1 раза, тучных клеток - в 32,2 раза. Максимальные значения численной плотности при этом были характерны для фибробластов, что связано с усилением их пролиферативной активности (см. рис. 1, б). Популяция фиброцитов при этом становилась меньше, чем в дерме у интактных животных в 1,6 раза (см. таблицу). Анализ площади профилей фибробластов у интактных животных показал неоднородность их клеточного состава по этому критерию. В зависимости от значений площади клетки были объединены в 5 основных групп (рис. 2). В результате аналогичного количественного анализа дермы у подопытных животных выявлено, что через 28 сут дистракции в дерме преобладали мелкие клетки с площадью менее 30 мкм2, доля которых составляла 42% от всех фибробластов, в 4,2 раза превышая значения у интактных животных. Одновременно было отмечено значительное уменьшение доли клеток площадью 31-60 и 61-90 мкм2 - в 1,8 и 7,8 раза соответственно. Содержание клеток площадью 91-120 мкм2 было таким же, как у интактных животных, и составляло 6%, при этом доля клеток площадью более 120 мкм2 (20%) превышала таковую в контроле в 20 раз. Анализ ЯЦО показал, что в периоде дистракции для фибробластов характерно уменьшение (по сравнению с интактной нормой) доли клеток с преобладанием цитоплазматического компонента и одновременное увеличение относительного содержания клеток с преобладанием ядерного компонента (рис. 3). Полученные результаты свидетельствуют о том, что на данном этапе ЧДО значительную долю клеток составляют малодифференцированные и/или юные формы фибробластов. Юные фибробласты имели веретеновидную форму с небольшими выпячиваниями цитоплазмы в виде отростков. На электронных микрофотографиях ядро таких клеток чаще было крупным и светлым, в цитоплазме выявлялись многочисленные рибосомы и полисомы, определялся хорошо развитый комплекс Гольджи. Через 30 сут фиксации конечности в аппарате дерма содержала умеренное количество клеточных элементов, представленных фибробластами, фиброцитами, макрофагами и тучными клетками, обнаруживающимися, преимущественно, в сосочковом слое. Коллагеновые и эластические волокна располагались более хаотично, чем в период дистракции, архитектоника сетчатого слоя была близка к норме, отличаясь лишь присутствием новообразованных коллагеновых и эластических структур. Количество эластических волокон в дерме увеличивалось. Их более тонкие конечные ветви проникали в сосочковый слой, достигая вершины кожных валиков. Толщина дермы на уровне сосочков не отличалась от таковой в норме, в межсосочковом пространстве она превышала ее на 8,6% (см. таблицу), что связано с активизацией процесса фибриллогенеза. При изучении клеточного состава выявлено, что к окончанию периода фиксации самой многочисленной являлась популяция макрофагов, численная плотность которой превышала контрольные значения в 12,9 раза и в 2,5 раза - значения в предыдущий период эксперимента. Аналогичные показатели фибробластов и периваскулярных клеток были в 1,32 и 1,7 раза ниже, чем в период дистракции и в 7 и 1,8 раза соответственно выше, чем у интактных животных. Повышалась численная плотность и тучных клеток по сравнению с таковой в период дистракции - в 1,47 раза, ас показателями у интактных животных - в 47,6 раза. Наименьшие показатели численной плотности были характерны для фиброцитов. Они в 4,8 раза были ниже контрольных значений и в 3 раза - в предыдущий экспериментальный период (см. таблицу). Через 30 сут фиксации в дерме было отмечено уменьшение количества клеток площадью 31-60 мкм2 (по сравнению с таковым в период дистракции в 2,1 раза и в 3,9 раза - в контроле). В этот период увеличивалась до значений в норме доля клеток площадью 61-90 мкм2 (26%). Соответственно в 5,5 и 1,4 раза по сравнению с данными в период дистракции и в 4,1 и 28 раз по сравнению с нормой возрастала доля клеток площадью 91-120 и более 120 мкм2. Пул фибробластических клеток площадью менее 30 мкм2 в дерме отсутствовал (см. рис. 2). Через 30 сут фиксации доли клеток с ЯЦО менее 0,5; 1,6-2 и более 2 значимо не изменялись (см. рис. 3). По сравнению с предыдущим этапом эксперимента в 1,4 раза увеличивалась доля клеток, ЯЦО которых составляло 0,6-1, достигая показателя в контроле. Доля клеток с ЯЦО 1,1-1,5 снизилась с 30% в период дистракции до 18%, продолжая превышать показатели в норме в 1,5 раза, что свидетельствует о незначительном уменьшении пула малодифференцированных фибробластов и появлении фибробластов большой площади с преобладающей долей цитоплазмы, следовательно - с большей биосинтетической активностью, о чем свидетельствововали и результаты трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). В цитоплазме таких клеток выявлено значительное количество гипертрофированных митохондрий, расширенные цистерны эндоплазматической сети, лизосомы (см. рис. 1, в). Наблюдались как свободные, так и прикрепленные к поверхности эндоплазматической сети рибосомы. Хроматин был равномерно распределен в ядре. Ядерная оболочка имела четкие непрерывные контуры. В более дифференцированных клетках объем цитоплазмы увеличивался, однако в ядрах разных клеток встречался как эухроматин, так и гетерохроматин. Клеток, дающих положительную реакцию с моноклональными антителами к Ki67, было меньше (см. рис. 1, г), чем в период дистракции. Через 30 сут после снятия аппарата фиброархитектоника сосочкового и сетчатого слоев дермы была близка к норме (см. рис. 1, д). Лишь отдельные коллагеновые и эластические волокна в глубоких слоях сетчатого слоя были направлены продольно. В дерме сохранялась увеличенная численная плотность клеток. Толщина дермы во всех участках была аналогична таковой в контроле (см. таблицу). В этот период эксперимента ведущими являлись клетки фибробластического дифферона. Численная плотность фибробластов в 5 раз превышала показатели в контроле. По сравнению с периодом фиксации на этом этапе ЧДО численная плотность фибробластов была меньше в 1,4 раза. Также отмечалось и резкое снижение (в 3 раза) численной плотности клеток макрофагального ряда, при этом по сравнению с контролем этот показатель оставался повышенным в 4,4 раза. Численная плотность периваскулярных и тучных клеток не отличалась от таковой в период фиксации, но была значимо выше, чем в контроле (в 1,9 и 36,5 раза соответственно). Численная плотность фиброцитов в этот период значительно (в 3,9 раза) увеличилась и приблизилась к показателям в норме (см. таблицу). Через 30 сут после снятия аппарата клетки площадью менее 30 мкм2 составляли 7%, что приближалось к показателям в контрольной группе. Доля клеток, площадь которых составляла 31-60 мкм2, по сравнению с их долей в период фиксации возрастала почти в 3 раза, оставаясь в 1,32 раза меньше, чем у интактных животных. Доля клеток площадью 61-90 мкм2 была такой же, как в предыдущий период эксперимента, ив 1,48 раза ниже, чем в контроле. Показатели ЯЦО клеточных групп приближались к значениям у интактных животных, за исключением пулов клеток с ЯЦО 1,6-2 и более 2, где значения в первом случае были вдвое ниже, а во втором - вдвое выше контрольных. Данные ТЭМ также свидетельствовали о преобладании в дерме дифференцированных фибробластов (см. рис. 1, e). Обсуждение полученных данных. Проведенные исследования показали, что в период дистракции выявляются одновременно признаки растяжения и гистогенеза дермы кожного покрова. В пользу первого утверждения свидетельствуют уменьшение толщины дермы, параллельная направлению воздействия растягивающих усилий ориентация коллагеновых и эластических волокон, в пользу второго - активные процессы коллагено-и эластогенеза. Кроме того, для периода дистракции характерно присутствие активированных камбиальных источников регенерации, пролиферация клеток и начало их дифференцировки, т. е. показатели, свойственные регенерационному (дистракционному) гистогенезу. Влияние направленного механического воздействия на состояние клеток и волокнистых структур отмечалось и в других работах [12, 15]. Выявлено, что кожа является вязкоэластичным материалом, и структурные изменения фибриллярного каркаса зависят от направления, в котором производится растяжение [14]. Определено стимулирующее влияние механического воздействия на клеточную пролиферацию, белковый синтез и сосудистое ремоделирование в дерме [8, 9, 16]. При этом в условиях, создаваемых в период дистракции, отмечаются как выраженная гетероморфия клеток ведущей фибробластической популяции, так и изменения соотношения макрофагов, периваскулярных и тучных клеток. К концу периода фиксации и после снятия аппарата показатели толщины дермы приближаются к норме. Ведущей клеточной популяцией, обеспечивающей процесс ремоделирования волокнистого компонента кожи к окончанию периода фиксации, является моноцитарно-макрофагальная, через 30 сут после снятия аппарата - вновь фибробластическая. В эти периоды продолжается дифференцировка клеток ведущей популяции, о чем свидетельствуют появление фибробластов с признаками отчетливо выраженной биосинтетической активности, уменьшение численной плотности клеток и преобладание межклеточного вещества. Постепенное снижение гетероморфии фибробластов, присутствие значительного количества макрофагов и тучных клеток свидетельствуют о фазе адаптивной перестройки. Адаптивность процессов, касающихся изменений в фибробластической клеточной популяции, подтверждается и работами других исследователей [1, 6, 7, 11]. Через 30 сут после снятия аппарата процесс адаптивной перестройки дермы приближается к завершению, что обеспечивается механической регуляцией генной экспрессии внеклеточного матрикса и позволяет поддерживать гомеостаз соединительной ткани дермы [17]. Таким образом, выявленные особенности строения дермы на каждом из этапов ЧДО, анализ реактивных изменений различных клеточных популяций могут служить критериями оценки фазности репаративных процессов, развивающихся в создаваемых условиях, и учитываться при разработке новых технологий лечения, ортопедических или терапевтических манипуляций, направленных на оптимизацию репаративно-восстановительных процессов при удлинении голени для обоснования их внедрения в клиническую практику. Автор благодарит администрацию и сотрудников лаборатории электронной микроскопии (зав. - проф. Л. А.Мусина) Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (г. Уфа) за помощь в выполнении электронномикроскопических исследований.

About the authors

Ye. N. Gorbach

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: gorbach.e@mail.ru

References

Supplementary files