СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ ДЕРМЫ ГОЛЕНИ СОБАКИ В УСЛОВИЯХ ЕЕ УДЛИНЕНИЯ МЕТОДОМ ЧРЕСКОСТНОГО ДИСТРАКЦИОННОГО ОСТЕОСИНТЕЗА

Полный текст

При удлинении конечности методом чрескостного дистракционного остеосинтеза (ЧДО) состояние параоссальных тканей играет важную роль. В связи с этим в последние годы в Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова особое внимание уделяется изучению мягкотканевого компонента, в том числе и кожи. Исследования акустических свойств кожного покрова пациентов с патологией различных сегментов конечностей в разные периоды лечения методом ЧДО выявили повышение коэффициента анизотропии, связанное с возрастанием скорости звука в коже, в направлении, совпадающем с вектором ее растяжения [10]. Согласно результатам гистологических исследований дозированно растянутого кожного покрова, существует его связь со структурной перестройкой фибриллярного остова дермы [3]. При реконструктивных операциях на кисти в условиях ЧДО прослежена общая тенденция к активному росту и утолщению пролиферирующих слоев эпидермиса и восстановлению нормального строения дермы [5]. Исследование содержания и распределения различных классов гликозаминогликанов (ГАГ) в тканях кожного покрова голени, удлиняемой по методу Г. А. Илизарова, показало, что пик накопления в дерме сульфатированных и несульфатированных ГАГ приходился на период фиксации, что свидетельствует об активном процессе фибриллогенеза и начале перестроечных процессов в волокнистом остове кожи [4]. Однако комплексного исследования состояния кожного покрова на разных структурных уровнях в условиях ЧДО с позиций современной гистологии [6] ранее не проводилось. Цель данного исследования - изучить особенности строения дермы кожного покрова голени у собаки на этапах ЧДО. Материал и методы. Исследована кожа передней поверхности голени 16 взрослых беспородных собак, которым через 5 сут после флексионной остеоклазии берцовых костей осуществляли удлинение голени с суточным темпом 1 мм за 4 приема. Величина удлинения голени составляла 17,6±0,4%. Животных выводили из опыта через 28 сут дистракции, 30 сут фиксации и через 30 сут после снятия аппарата. Уход, оперативные вмешательства, эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». В качестве контроля исследовали кожный покров 6 интактных собак. Часть материала фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином - эозином, по Ван-Гизону, орсеином по Тенцеру-Унну. Пролиферативную активность клеток оценивали на парафиновых срезах путем выявления антигена Ki67 стрептавидин-биотиновым методом (протокол и реактивы фирмы Novocastra, Великобритания). Другую часть фрагментов кожи фиксировали в смеси аль-вый и сетчатый слои. В сосочковом слое наблю дегидных фиксаторов, дегидратировали и заливали в аралдит. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим с постановкой ШИК-реакции. Оцифровку изображений выполняли на аппартно-программном комплексе ДиаМорф (Россия). Измерение толщины дермы, площади клеток фибробластического дифферона, их ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) осуществляли при помощи программы-анализатора изображений ВидеоТесТ-Морфология 4.0 (Россия). В выборке измерений не менее 300 клеток определяли соотношение клеток с различной площадью и ЯЦО. Численную плотность клеток дермы рассчитывали на 1 мм2, предварительно подсчитывая количество клеток в поле зрения микроскопа при общем увеличении 640. Статистическую обработку данных выполняли с использованием компьютерной программы AtteStat [2]. Нормальность распределения определяли, используя критерии типа Колмагорова и Смирнова, а также критерий Шапиро-Уилка. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента для независимых выборок и считали значимыми при Р<0,05. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB Bromma Ultratome Nova (LKB, Швеция), контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по E. S. Reynolds [13]. После этого материал изучали при помощи трансмиссионного электронного микроскопа JEM-7А (Jeol, Япония), архитектонику волокнистого остова дермы - с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Jeol, Япония). Результаты исследования. Через 28 сут дистракции в дерме различались сосочкодалась активная макрофагальная реакция, менее выраженная в сетчатом слое кожи. Вблизи микрососудов были отмечены скопления тучных клеток. В сосочковом и наружной части сетчатого слоев дермы наблюдалось значительное количество микрососудов, преимущественно капиллярного типа. Коллагеновые волокна имели более плотное, чем в контроле, расположение и были направлены вдоль вектора растяжения (рис. 1, а). Наряду с крупными пучками волокон, определялись более тонкие сетчатые структуры и микрофибриллярный компонент, обнаруживающийся вокруг фибробластов. В сетчатом слое дермы эластические волокна имели плоскую и цилиндрическую форму и были более короткими и утолщенными, чем в контроле. В сосочковом слое имелись тонкие разветвленные эластические волокна, формирующие нежные сетчатые структуры. Толщина дермы на уровне сосочков и между ними по сравнению с контролем уменьшалась на 5 и 6,8% соответственно (таблица). К окончанию периода дистракции в дерме отмечалось значимое повышение численной плотности всех типов встречаемых в ней клеток, за исключением фиброцитов. Численная плотность фибробластов превышала показатели контроля в 9,4 раза, периваскулярных клеток - в 3 раза, клеток макрофагального ряда - в 5,1 раза, тучных клеток - в 32,2 раза. Максимальные значения численной плотности при этом были характерны для фибробластов, что связано с усилением их пролиферативной активности (см. рис. 1, б). Популяция фиброцитов при этом становилась меньше, чем в дерме у интактных животных в 1,6 раза (см. таблицу). Анализ площади профилей фибробластов у интактных животных показал неоднородность их клеточного состава по этому критерию. В зависимости от значений площади клетки были объединены в 5 основных групп (рис. 2). В результате аналогичного количественного анализа дермы у подопытных животных выявлено, что через 28 сут дистракции в дерме преобладали мелкие клетки с площадью менее 30 мкм2, доля которых составляла 42% от всех фибробластов, в 4,2 раза превышая значения у интактных животных. Одновременно было отмечено значительное уменьшение доли клеток площадью 31-60 и 61-90 мкм2 - в 1,8 и 7,8 раза соответственно. Содержание клеток площадью 91-120 мкм2 было таким же, как у интактных животных, и составляло 6%, при этом доля клеток площадью более 120 мкм2 (20%) превышала таковую в контроле в 20 раз. Анализ ЯЦО показал, что в периоде дистракции для фибробластов характерно уменьшение (по сравнению с интактной нормой) доли клеток с преобладанием цитоплазматического компонента и одновременное увеличение относительного содержания клеток с преобладанием ядерного компонента (рис. 3). Полученные результаты свидетельствуют о том, что на данном этапе ЧДО значительную долю клеток составляют малодифференцированные и/или юные формы фибробластов. Юные фибробласты имели веретеновидную форму с небольшими выпячиваниями цитоплазмы в виде отростков. На электронных микрофотографиях ядро таких клеток чаще было крупным и светлым, в цитоплазме выявлялись многочисленные рибосомы и полисомы, определялся хорошо развитый комплекс Гольджи. Через 30 сут фиксации конечности в аппарате дерма содержала умеренное количество клеточных элементов, представленных фибробластами, фиброцитами, макрофагами и тучными клетками, обнаруживающимися, преимущественно, в сосочковом слое. Коллагеновые и эластические волокна располагались более хаотично, чем в период дистракции, архитектоника сетчатого слоя была близка к норме, отличаясь лишь присутствием новообразованных коллагеновых и эластических структур. Количество эластических волокон в дерме увеличивалось. Их более тонкие конечные ветви проникали в сосочковый слой, достигая вершины кожных валиков. Толщина дермы на уровне сосочков не отличалась от таковой в норме, в межсосочковом пространстве она превышала ее на 8,6% (см. таблицу), что связано с активизацией процесса фибриллогенеза. При изучении клеточного состава выявлено, что к окончанию периода фиксации самой многочисленной являлась популяция макрофагов, численная плотность которой превышала контрольные значения в 12,9 раза и в 2,5 раза - значения в предыдущий период эксперимента. Аналогичные показатели фибробластов и периваскулярных клеток были в 1,32 и 1,7 раза ниже, чем в период дистракции и в 7 и 1,8 раза соответственно выше, чем у интактных животных. Повышалась численная плотность и тучных клеток по сравнению с таковой в период дистракции - в 1,47 раза, ас показателями у интактных животных - в 47,6 раза. Наименьшие показатели численной плотности были характерны для фиброцитов. Они в 4,8 раза были ниже контрольных значений и в 3 раза - в предыдущий экспериментальный период (см. таблицу). Через 30 сут фиксации в дерме было отмечено уменьшение количества клеток площадью 31-60 мкм2 (по сравнению с таковым в период дистракции в 2,1 раза и в 3,9 раза - в контроле). В этот период увеличивалась до значений в норме доля клеток площадью 61-90 мкм2 (26%). Соответственно в 5,5 и 1,4 раза по сравнению с данными в период дистракции и в 4,1 и 28 раз по сравнению с нормой возрастала доля клеток площадью 91-120 и более 120 мкм2. Пул фибробластических клеток площадью менее 30 мкм2 в дерме отсутствовал (см. рис. 2). Через 30 сут фиксации доли клеток с ЯЦО менее 0,5; 1,6-2 и более 2 значимо не изменялись (см. рис. 3). По сравнению с предыдущим этапом эксперимента в 1,4 раза увеличивалась доля клеток, ЯЦО которых составляло 0,6-1, достигая показателя в контроле. Доля клеток с ЯЦО 1,1-1,5 снизилась с 30% в период дистракции до 18%, продолжая превышать показатели в норме в 1,5 раза, что свидетельствует о незначительном уменьшении пула малодифференцированных фибробластов и появлении фибробластов большой площади с преобладающей долей цитоплазмы, следовательно - с большей биосинтетической активностью, о чем свидетельствововали и результаты трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). В цитоплазме таких клеток выявлено значительное количество гипертрофированных митохондрий, расширенные цистерны эндоплазматической сети, лизосомы (см. рис. 1, в). Наблюдались как свободные, так и прикрепленные к поверхности эндоплазматической сети рибосомы. Хроматин был равномерно распределен в ядре. Ядерная оболочка имела четкие непрерывные контуры. В более дифференцированных клетках объем цитоплазмы увеличивался, однако в ядрах разных клеток встречался как эухроматин, так и гетерохроматин. Клеток, дающих положительную реакцию с моноклональными антителами к Ki67, было меньше (см. рис. 1, г), чем в период дистракции. Через 30 сут после снятия аппарата фиброархитектоника сосочкового и сетчатого слоев дермы была близка к норме (см. рис. 1, д). Лишь отдельные коллагеновые и эластические волокна в глубоких слоях сетчатого слоя были направлены продольно. В дерме сохранялась увеличенная численная плотность клеток. Толщина дермы во всех участках была аналогична таковой в контроле (см. таблицу). В этот период эксперимента ведущими являлись клетки фибробластического дифферона. Численная плотность фибробластов в 5 раз превышала показатели в контроле. По сравнению с периодом фиксации на этом этапе ЧДО численная плотность фибробластов была меньше в 1,4 раза. Также отмечалось и резкое снижение (в 3 раза) численной плотности клеток макрофагального ряда, при этом по сравнению с контролем этот показатель оставался повышенным в 4,4 раза. Численная плотность периваскулярных и тучных клеток не отличалась от таковой в период фиксации, но была значимо выше, чем в контроле (в 1,9 и 36,5 раза соответственно). Численная плотность фиброцитов в этот период значительно (в 3,9 раза) увеличилась и приблизилась к показателям в норме (см. таблицу). Через 30 сут после снятия аппарата клетки площадью менее 30 мкм2 составляли 7%, что приближалось к показателям в контрольной группе. Доля клеток, площадь которых составляла 31-60 мкм2, по сравнению с их долей в период фиксации возрастала почти в 3 раза, оставаясь в 1,32 раза меньше, чем у интактных животных. Доля клеток площадью 61-90 мкм2 была такой же, как в предыдущий период эксперимента, ив 1,48 раза ниже, чем в контроле. Показатели ЯЦО клеточных групп приближались к значениям у интактных животных, за исключением пулов клеток с ЯЦО 1,6-2 и более 2, где значения в первом случае были вдвое ниже, а во втором - вдвое выше контрольных. Данные ТЭМ также свидетельствовали о преобладании в дерме дифференцированных фибробластов (см. рис. 1, e). Обсуждение полученных данных. Проведенные исследования показали, что в период дистракции выявляются одновременно признаки растяжения и гистогенеза дермы кожного покрова. В пользу первого утверждения свидетельствуют уменьшение толщины дермы, параллельная направлению воздействия растягивающих усилий ориентация коллагеновых и эластических волокон, в пользу второго - активные процессы коллагено-и эластогенеза. Кроме того, для периода дистракции характерно присутствие активированных камбиальных источников регенерации, пролиферация клеток и начало их дифференцировки, т. е. показатели, свойственные регенерационному (дистракционному) гистогенезу. Влияние направленного механического воздействия на состояние клеток и волокнистых структур отмечалось и в других работах [12, 15]. Выявлено, что кожа является вязкоэластичным материалом, и структурные изменения фибриллярного каркаса зависят от направления, в котором производится растяжение [14]. Определено стимулирующее влияние механического воздействия на клеточную пролиферацию, белковый синтез и сосудистое ремоделирование в дерме [8, 9, 16]. При этом в условиях, создаваемых в период дистракции, отмечаются как выраженная гетероморфия клеток ведущей фибробластической популяции, так и изменения соотношения макрофагов, периваскулярных и тучных клеток. К концу периода фиксации и после снятия аппарата показатели толщины дермы приближаются к норме. Ведущей клеточной популяцией, обеспечивающей процесс ремоделирования волокнистого компонента кожи к окончанию периода фиксации, является моноцитарно-макрофагальная, через 30 сут после снятия аппарата - вновь фибробластическая. В эти периоды продолжается дифференцировка клеток ведущей популяции, о чем свидетельствуют появление фибробластов с признаками отчетливо выраженной биосинтетической активности, уменьшение численной плотности клеток и преобладание межклеточного вещества. Постепенное снижение гетероморфии фибробластов, присутствие значительного количества макрофагов и тучных клеток свидетельствуют о фазе адаптивной перестройки. Адаптивность процессов, касающихся изменений в фибробластической клеточной популяции, подтверждается и работами других исследователей [1, 6, 7, 11]. Через 30 сут после снятия аппарата процесс адаптивной перестройки дермы приближается к завершению, что обеспечивается механической регуляцией генной экспрессии внеклеточного матрикса и позволяет поддерживать гомеостаз соединительной ткани дермы [17]. Таким образом, выявленные особенности строения дермы на каждом из этапов ЧДО, анализ реактивных изменений различных клеточных популяций могут служить критериями оценки фазности репаративных процессов, развивающихся в создаваемых условиях, и учитываться при разработке новых технологий лечения, ортопедических или терапевтических манипуляций, направленных на оптимизацию репаративно-восстановительных процессов при удлинении голени для обоснования их внедрения в клиническую практику. Автор благодарит администрацию и сотрудников лаборатории электронной микроскопии (зав. - проф. Л. А.Мусина) Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (г. Уфа) за помощь в выполнении электронномикроскопических исследований.

Об авторах

Елена Николаевна Горбач

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: gorbach.e@mail.ru
лаборатория морфологии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы