CHANGES IN CALBINDIN-CONTAINING NEURONS IN THE POSTERIOR HORNS OF THE GRAY MATTER OF THE SPINAL CORD AND IN THE SENSORY GANGLION OF THE SPINAL NERVE IN ALBINO RAT AFTER SENSORY DEPRIVATION

Full Text

В первичных чувствительных нейронах локализованы TRPV1-рецепторы (Transient Receptor Potential Vanilloid 1), которые взаимодействуют с капсаицином - производным ваниллоидов [7, 12, 17, 19]. Капсаицин - нейротоксин, в небольших дозах оказывает избирательное влияние на большинство афферентных тонких безмиелиновых С-волокон и частично на тонкие миелиновые А-δ-волокна. Все эффекты капсаицина зависят от вводимой дозы и длительности его применения, поэтому в зависимости от целей исследования, вида и возраста животного применяются раз личные дозы капсаицина (от 50 до 150 мг/кг) и способы его введения (1-кратное, многократное). Низкие дозы активируют афферентные терминали, в результате чего проявляется его аналгезирующий эффект [11, 24]. При 1-кратном введении капсаицина новорожденным животным обнаруживается его нейротоксическое действие [2, 3, 11]. При многократном применении постепенно увеличивающихся доз капсаицин вызывает десенситизацию, блокаду аксоплазматического тока, истощение запаса нейропептидов, дегенерацию чувствительных нейронов [24]. Реакция на введение нейротоксической дозы капсаицина отражается на функционально различных нейронах. Ряд авторов предполагают, что реакция, вызываемая введением капсаицина, может быть изучена не ранее, чем через 2 нед с момента его введения [6]. Другие исследователи утверждают, что процесс деафферентации проявляется уже спустя 3 сут после введения капсаицина [7]. Нейротоксическое действие капсаицина объясняется также избыточным внутриклеточным накоплением ионов Са2+ и Nа+, что ведет к активации протеаз и гибели клеток [8, 13]. Кальбиндин (КБ) является внутриклеточным кальций-связывающим белком, который участвует в транс-клеточном транспорте ионов кальция и модулирует эффекты, возникающие в ответ на изменения внутриклеточной концентрации кальция, функционируя в качестве своеобразного буфера и обеспечивая кальциевый гомеостаз [18, 22]. КБ присутствует в различных типах клеток как в центральной [14, 16, 26], так и в периферической нервной системе [1, 4, 8, 15]. Показано, что дисфункция кальциевой буферной системы в чувствительных нейронах может приводить к их дегенерации [9]. В нервных клетках выделяют особую роль кальций-связывающих белков, которая заключается в нейропротекции и связана с их избирательной устойчивостью к глутамат-индуцированной нейротоксичности [20, 24]. Причины стойких изменений нейрональной системы заднего рога спинного мозга (СМ) в результате повреждающей деафферентации изучены далеко не полностью, однако, некоторые механизмы развития сенситизации уже определены. Нейронные сети заднего рога, образуя функционально различные модули, содержат интернейроны, которые способны изменяться под влиянием передаваемой сенсорной информации с первичных афферентных А-иС-волокон [27]. Цель настоящей работы - выявить морфометрические и структурные изменения нейронов, содержащих КБ с молекулярной массой 28 килодальтон (calbindin 28 kDa) в заднем роге СМ и чувствительном узле спинномозгового нерва (ЧУСН) на фоне дефицита афферентации, вызванной капсаицином. Материал и методы. Исследование проведено на самках крыс линии Вистар массой 200±10 г, которые были разделены на 2 группы: контрольную (n=4) и подопытную (n=4). В подопытной группе моделировали деафферентацию путем подкожного введения капсаицина (N-vanillylonanamide, Sigma), который растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS), 0,01 М, pH 7,4 (БиолоТ, Россия), содержащем 10% этилового спирта и 10% Твин-80. Суммарную дозу капсаицина (125 мг/кг) крысам вводили в течение 3 сут: в 1-е сутки - 25 мг/кг; во 2-еи 3-и сутки - по 50 мг/кг [5]. У животных подопытной группы материал брали на 14-е сутки после последнего введения раствора капсаицина, одновременно с взятием материала у крыс контрольной группы. Все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Эвтаназию осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии PBS, 0,01 М, pH 7,4, содержащего гепарин (5 ЕД/л), затем 4% раствора параформальдегида (Sigma, США) на PBS. Объектом исследования служили нейроны заднего рога II грудного сегмента СМ (TII) и чувствительного узла второго грудного спинномозгового нерва. Выделенный СМ с корешками и чувствительными узлами фиксировали в 4% растворе параформальдегида на PBS в течение 2 ч при 4 ºС, после чего промывали 3-кратно в PBS в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы (Panreac, Испания) на 24 ч при 4 ºС. Из фиксированного СМ, ориентируясь по корешкам, выделяли TII и ЧУСН, которые замораживали в криогеле Tissue-Tek O. C. T. Compound (Sakura Finetek, Нидерланды). Из выделенных объектов с помощью криостата Shandon E (Thermo Scientific, Великобритания) готовили поперечные серийные срезы толщиной 14 мкм. Для выявления нейронов использовали каждый 5-й срез - всего 10 срезов с каждого объекта. Выявление КБ-иммунопозитивных (КБ-ИП) нейронов проводили по ранее описанной методике с использованием меченых антител [1]: первичные антитела (Abcam, Великобритания) - поликлональные кроличьи к КБ, разведение 1:500; вторичные - ослиные (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США) к кроличьему иммуноглобулину G, конъюгированные с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), разведение 1:200, флюоресцирующим в зеленой области спектра. Мечение всей популяции нейронов по Нисслю проводили красителем, флюоресцирующим в красной области спектра, NeuroTrace Red Fluorescent Nissl Stains (Molecular Probes, США), разведение 1:200. Далее срезы отмывали в растворе PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции VectaShield (Vector Laboratories, США). С целью контроля, для исключения неспецифической реакции, часть срезов инкубировали без первичных антител. Препараты анализировали под микроскопом Олимпус BX43 (Olympus Corporation, Япония), оснащенным соответствующим набором флюоресцентных фильтров-блоков. Изображения получали при помощи охлаждаемой цифровой видеокамеры TСC-5.0ICE (Tucsen, Китай). На срезах с использованием объектива 10×/0,30 изучали топографические характеристики интернейронов в заднем роге СМ, устанавливая их соответствие пластинам Рекседа [21], конфигурация которых соответствовала верхним грудным сегментам [23]. Измерение площади сечения всех ИП-нейронов проводили, используя программу Image J (NIH, США) на изображениях срезов, полученных при объективе 20×/0,50. На этих же срезах подсчитывали число ИП-нейронов: в ЧУСН - на площади 0,01 мм2; в дорсальном роге - в каждой пластине серого вещества СМ. Долю ИП-нейронов в ЧУСН определяли как их отношение к общему числу нейронов, которое принимали за 100%. Для характеристики нейронов ЧУСН по площади сечения использовали 5 размерных классов: до 200 мкм2 (очень малые), 201-400 мкм2 (малые), 401- 600 мкм2 (средние), 601-800 мкм2 (крупные), более 801 мкм2 (очень крупные). Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с видимым ядрышком. Для определения средних арифметических и их стандартных ошибок использовали программу Statistica, версия 10 (StatSoft, Inc., 2011). Для поиска различий средних значений применяли анализ вариаций ANOVA и считали их значимыми при P<0,05. Результаты исследования. В ЧУСН крыс в обеих группах наблюдения выявлялись КБ-ИП-нейроны и нервные волокна, глиоциты были иммунонегативными. В контроле на всем срезе узла КБ-ИП-нейроны располагались как одиночно, так и образовывали кластеры от 2 до 8 клеток различных размеров (рис. 1, а). Вся популяция КБ-ИП-нейронов имела зеленую флюоресценцию, КБ распределялся в цитоплазме диффузно, в части клеток определялся в ядрах. По распределению продукта реакции всю популяцию КБ-ИП-нейронов можно разделить на 3 субпопуляции: первую - представленную нейронами малых размеров с более интенсивной флюоресценцией в ядре, чем в цитоплазме; вторую - нейронами крупных размеров с более интенсивной флюоресценцией в цитоплазме, чем в ядре; третью - нейронами различных размеров с одинаково слабой флюоресценцией в ядре и в цитоплазме. Было обнаружено, что до 30% нейронов ЧУСН содержали КБ. Они были представлены клетками всех размерных классов: от очень малых до очень крупных. Около 50% составляли нейроны малых, около 30% - средних размеров. Остальные нейроны в равных количествах относились к ИП-клеткам очень малых, крупных и очень крупных размеров (табл. 1). После введения капсаицина в ЧУСН на срезе узла обнаружены как одиночные КБ-ИПнейроны, так и их кластеры, которые насчитывали по 2 клетки, на 1 срез приходилось 2-3 таких кластера. Практически все КБ-ИП-нейроны узла имели неправильную форму и «ячеистый» вид. В одних клетках изменения касались только ядра (см. рис. 1, б), которое имело полости различных размеров и неровные контуры. В других клетках полости заполняли не только ядро, но и нейроплазму (см. рис. 1, в), перинуклеарная зона отсутствовала. Возле некоторых таких клеток наблюдалась отчетливо выраженная глиальная реакция (см. рис. 1, г), встречались остаточные узелки (см. рис. 1, в). В опыте содержание КБ-ИП-нейронов в ЧУСН уменьшилось на 60%, но средние размеры этой популяции клеток увеличились на 25% по сравнению с контролем (см. табл. 1). Анализ клеточного состава КБ-ИП-нейронов в подопытной группе обнаружил, что популяция состояла из клеток всех размерных классов. Существенная часть нейронов имели малые и средние размеры - по 30%, крупные и очень крупные размеры - по 15%, незначительная оставшаяся часть нейронов узла были очень малых размеров (см. табл. 1). Как видно, проведенная химическая деафферентация изменила распределение размерных групп: в 1,6 раза уменьшилась доля нейронов малых размеров, в 2 раза увеличилась доля нейронов крупных и очень крупных размеров. В контроле в заднем роге СМ КБ-ИПинтернейроны были выявлены во всех пластинах - с I по V. Интенсивность свечения ИП-интернейронов не менялась в пределах указанных пластин серого вещества. В пластинах I-II на каждом срезе располагались КБ-ИПинтернейроны, которые имели округлую форму, для них характерным было свечение только клеточных тел (рис. 2, а). В пластинах III-IV на каждом срезе выявлялись КБ-ИП-вытянутые интернейроны, флюоресценция обнаруживалась и в отростках этих клеток. Тела клеток располагались вдоль дорсовентральной оси, их отростки протяженностью до 20 мкм распространялись в дорсальном и вентральном направлениях. В пластине V на каждом 4-м срезе выявлялось от 1 до 4 КБ-ИПинтернейронов треугольной и вытянутой формы, расположенных параллельно дорсовентральной оси, флюоресцирующие отростки которых длиной до 10 мкм распространялись в дорсальном направлении, а длиной до 20 мкм - в вентромедиальном направлении. В области всего медиального края (МК) заднего рога СМ на каждом 3-м срезе выявляли 3-4 КБ-ИП-интернейрона круглой и вытянутой формы с более длинными (до 35 мкм) флюоресцирующими отростками, ориентированными в дорсовентральном направлении. В TII СМ максимальное количество КБ-ИПинтернейронов выявлялось в пластине II (табл. 2), меньше их было в пластинах I и III-IV - в 3,2 и 2,9 раза соответственно, а минимальное число отмечалось в пластине V и в области МК, где определялись единичные КБ-ИП-интернейроны. Площадь КБ-содержащих клеток в заднем роге сегмента TII колебалась от 46,2 до 147 мкм2 (см. табл. 2). При этом самыми крупными были интернейроны пластины V, а самыми мелкими - интернейроны пластины II. Промежуточные размеры имели клетки пластины III-IV и МК, КБ-ИПинтернейроны пластины I были больше таковых пластины II на 18%, но меньше на 26% ИП-клеток пластин III-IV заднего рога. После введения капсаицина КБ-ИП-интернейроны выявлялись в аналогичных пластинах заднего рога СМ, флюоресценция в их отростках наблюдалась в пластинах III-IV, V и МК. Характерной структурной особенностью КБ-ИПинтернейронов пластин I-II было крупное КБ-негативное ядро и наличие узкого ободка цитоплазмы (см. рис. 2, б). В пластине V тела КБ-ИПинтернейронов, имея «ячеистый» вид, содержали различного размера полости, которые были локализованы преимущественно в ядре, в небольшой части клеток - в ядре и в цитоплазме (см. рис. 2, в). В пластинах III-IV и в области МК морфологически измененных КБ-ИП-интернейров не обнаружено. В опыте в TII СМ максимальное количество КБ-ИП-интернейронов было выявлено также, как и в контроле, в пластине II (см. табл. 2), меньше их было в пластинах I и III-IV (в 2,9 и 2,7 раза соответственно), а минимальное число - в пластине V и области МК, где выявлялись единичные клетки. Площадь КБ-содержащих клеток колебалась в пределах 61,4-187 мкм2 (см. табл. 2). При этом наиболее крупными были интернейроны пластины V, а мелкими - интернейроны пластины II. Промежуточные размеры имели клетки пластины III-IV и МК, КБ-ИПинтернейроны пластины I были больше таковых пластины II на 10%, но меньше на 16%, чем пластин III-IV. После введения капсаицина число ИП-клеток уменьшилось в пластинах: I - на 8%, II - на 18%, III-IV - на 15% (P<0,05). Средние размеры ИП-интернейронов, напротив, увеличились практически во всех пластинах СМ, где превышение составило: в I - 23%, во II - 33%, в V - 27%, в области МК - 10%. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования установлено, что у взрослых белых крыс во втором грудном ЧУСН присутствуют нейроны, проявляющие КБ-иммунореактивность и составляющие до 30% нейронов узла, что совпадает с данными других исследований [2, 4, 15]. Указанная популяция представлена нейронами всех размерных классов, от очень мелких до очень крупных, более 50% этих ИП-нейронов имеют малые (201-400 мкм2) и средние (401-600 мкм2) размеры. Размеры КБ-ИП-нейронов ЧУСН связывают с выполняемой ими ноцицептивной функцией [10, 24], о чем свидетельствует присутствие КБ в мелких пептидергических нейронах [26]. В мелких нейронах, содержащих TRPV1, КБ участвует в хемосенсорных функциях [12]. В сером веществе заднего рога СМ КБ-ИП-интернейроны располагаются во всех его пластинах, более плотно в пластине II, что согласуется с данными других исследователей [4, 14]. Самыми мелкими КБ-ИП-интернейронами являются клетки пластины II - их средние размеры не превышают 50 мкм2, самыми крупными - площадью более 100 мкм2 - интернейроны пластины V. Введение капсаицина, агониста TRPV1рецепторов, вызывает уменьшение доли КБ-ИПнейронов как в ЧУСН - на 60%, так и в пластинах заднего рога I-II-III - на 8, 18, 15% соответственно. При этом, средняя площадь сечения КБ-содержащих нейронов, напротив, увеличивается за счет внутриклеточного отека: окраска по Нисслю позволила обнаружить после введения капсаицина центральный хроматолиз, вакуолизацию ядра и цитоплазмы, свидетельствующие о гидропической дистрофии нейронов ЧУСН и заднего рога. О необратимости выявленных изменений свидетельствуют деформация ядра, лизис ядрышка, уменьшение числа КБ-содержащих нейронов, признаки нейронофагии с образованием остаточных узелков на месте погибших клеток. Как и другие исследования [3, 25], результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что после введения капсаицина в ЧУСН происходит гибель нейронов независимо от их размеров, механизм его повреждающего действия связан с внутриклеточным накоплением ионов кальция, следствием чего являются развитие отека и последующая деструкция клеток. Вовлечение интернейронов I, II и V пластин заднего рога в деструктивный процесс, возможно, объясняется прекращением передачи информации с первичных чувствительных нейронов [27]. В результате отсутствия ноцицептивной афферентации развивается состояние, при котором интернейроны заднего рога СМ воспринимают неболевые стимулы как ноцицептивные. Это ведет к формированию центральной гиперчувствительности (гиперальгезия) интернейронов заднего рога СМ [6, 24], которая поддерживается длительной активацией интернейронов заднего рога, особенно пластин I, II и V, с выделением глутамата, что вызывает чрезмерное накопление в постсинаптическом нейроне ионов кальция, оказывая нейротоксическое действие [20]. Итак, в результате деафферентации развиваются однотипные морфометрические и структурные изменения КБ-ИП-нейронов как в ЧУСН, так и в заднем роге серого вещества СМ.

About the authors

V. V. Shilkin

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: shilkin39@mail.ru
Department of Normal Physiology with Biophysics

V. V. Porseva

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: vvporseva@mail.ru
Department of Normal Physiology with Biophysics

P. M. Masliukov

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: mpm@yma.ac.ru
Department of Normal Physiology with Biophysics

A. A. Strelkov

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: strelkov-yar@mail.ru
Department of Normal Physiology with Biophysics

References

Supplementary files