Biocompatibility of dicalcium phosphate dihydrate obtained by low-temperature synthesis and doped with barium cations for application in regenerative medicine.

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Для устранения врожденных или приобретенных дефектов костной ткани и стимуляции регенеративных процессов в современной регенеративной медицине всё чаще используются синтетические материалы на основе кальций-фосфатных соединений. Биоактивность имплантируемых синтезированных материалов во многом зависит от взаимодействия составляющих их молекул, стволовых и остеокластных клеток-предшественниц на границе раздела фаз. Таким образом, изменение химического состава имплантата может существенно повлиять на эффективность лечения [1].

Основной неорганический компонент костной ткани – гидроксиапатит (ГАп) – не является однородным материалом. Помимо ионов Ca²⁺ и PO₄^3- в структуру ГАп входят ионы различных металлов, которые обеспечивают специфическую стехиометрию и тип кристаллической решетки, свойственные как различным типам ГАп для того или иного вида костной ткани (губчатой или компактной) или различных ее участков (зон роста, основного осевого напряжения и т.д.). Помимо этого, известно, что в процессе регенерации костной ткани присутствие в следовых количествах различных ионов, например таких как Mg²⁺, Ba²⁺, Sr²⁺, Zn²⁺, F⁻, SiO₄⁴⁻ и т.д., также играет важную роль [2-3]. Различные исследования показали, что добавление микроэлементов в кальций-фосфатные материалы может обеспечить контролируемую деградацию, повысить механическую прочность материалов и положительно влиять на их биологические свойства [4-6].

Несмотря на то, что барий (Ba²⁺) долго считался токсичным элементом, на сегодняшний день катионы данного металла считаются перспективными для включения в состав остеопластических материалов [7-8]. Несмотря на то, что барий не считается жизненно важным элементом, было обнаружено, что поглощённые ионы бария распределяются по кровотоку и откладываются в основном в костях (примерно 90% от общего количества в организме, от 0,5 до 10 мкг/г [9]) и, преимущественно, в зонах роста костей и областях формирования костной мазоли [7]. Как и другие элементы, барий может попадать в организм с воздухом, пищей и питьевой водой, содержащей этот элемент; однако количество поступающего в норме бария, как правило, недостаточно для возникновения каких-либо проблем со здоровьем: потребление бария с пищей у взрослых составляет 0,4–1,8 мг в день, а токсичным является воздействие 3–4 г бария [8-11]. Кроме того, Агентство по охране окружающей среды США (EPA) пришло к выводу, что в отличие от других тяжёлых металлов барий не оказывает канцерогенного воздействия на человека [12].

В клинической практике соединения бария используются для улучшения визуализации рентгенопрозрачных материалов и тканей [6], а в последние годы интерес исследователей вызывает использование бария в качестве включения в различные исследуемые материалы. Например, было показано, что биостёкла, содержащие барий, усиливали пролиферацию клеток глиобластомы и гранулоцитарных клеток не вызывая цитотоксичности. Кроме того, в том же исследовании была оценена способность Ba²⁺ предотвращать вызванное липополисахаридом усиление выработки интерлейкина-6 (IL-6), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-10 (IL-10), что может указывать на наличие у ионов бария противовоспалительного эффекта [13].

Так же Лю и др. сообщили, что добавление BaSO₄ может улучшить механические свойства и рентгеноконтрастность, не ухудшая при этом биосовместимость, биоразлагаемость и остеоинтеграцию инъекционного кальцийфосфатного цемента, смешанного с крахмалом [14]. Помимо этого, сообщается о способности ионов бария стимулировать образование ГАп in vitro. С помощью ИК-Фурье-спектроскопии и рентгеновской дифракции было показано, что при погружении стёкол с интеркалированным барием в среду SBF произошло образование слоя гидроксикарбонатного апатита. Кроме того, анализ гемолитической активности показал, что биосовместимость всех биоактивных стёкол улучшилась за счёт включения оксида бария в состав материала [15].

В ряду исследований барий использовался как связывающий агент для улучшения общих свойств полимеров [16-18]. Сообщалось, что материалы, содержащие барий, создают благоприятную среду для роста клеток. Например показано, что использование ионов бария значительно повысило пролиферацию инкапсулированных модельных стволовых клеток. Микрокапсулы из альгинатно-желатиновой смеси, сшитой барием, протестированные в качестве скаффолда для костной ткани, показали значительное увеличение количества остеобластов через 21 день с отложением новообразованного костного матрикса. Гемопоэтические стволовые клетки, культивируемые в микрокапсулах, также показали 2-кратное увеличение без добавления каких-либо факторов роста [19-20].

Несмотря на встречающиеся позитивные данные, форма включения и дозозависимое влияние бария до сих пор не изучено. Помимо этого, несмотря на то, что барий обладает высоким потенциалом в качестве хорошей замены широко используемых ионов металлов, у него есть определённые недостатки. Например, сообщается, что ионы Ba²⁺ могут оказывать токсичное воздействие на клетки и негативно влиять на клеточную пролиферацию и дифференцировку [21], в то время как нерастворимые соединения бария, такие как титанат бария, могут улучшать остеогенную дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток [22]. Кроме того, Морс и др. наблюдали снижение жизнеспособности мононуклеарных фагоцитов под воздействием наночастиц бария. Представленные ими результаты показали, что барий, усиливает высвобождение супероксида, снижает высвобождение внутриклеточного кальция и увеличивает гибель клеток путём апоптоза [23]. Учитывая имеющиеся данные и тот факт, что барий может проявлять токсические свойства, к использованию бария в качестве сшивающего или легирующего агента по-прежнему относятся с осторожностью [10, 24].

На основании вышесказанного можно сказать, что фактических данных об общем биологическом воздействии бария по-прежнему недостаточно. а целесообразность его включения в синтетические кальций-фосфатные материалы требует дальнейших исследований.

 

 

Цель

Целью данной работы является оценка влияния легирования катионами бария порошка дигидрата дикальцийфосфата (ДКФД), полученного с применением низкотемпературного синтеза, на его физико-химические и биологические свойства.

Материалы и Методы

Сканирующая электронная микроскопия. Морфологию исходного дикальцийфосфат дигидрата и барий-замещенных образцов (Ва-ДКФД) изучали с использованием сканирующего электронного микроскопа Tescan VEGA III (СЭМ, Чехия), оснащенного системами энергодисперсионной спектроскопии для анализа химического состава (ЭДС; INCA Energy Oxford Instruments, Великобритания). Предварительно образцы покрывали золотом на установке Q150R Quorum Technologies (Великобритания). Изображения поверхности материалов получали при давлении 7,3×10^-2 Па в колонке и 1,5×10^-1 Па в камере.

Энергодисперсионную рентгеновскую спектроскопию (ЭДС) (ПО Oxford AZtecO 4.3) использовали для исследования примесей на поверхности порошков.

Рентгенофазовый анализ (РФА) проводили для оценки кристаллографической структуры ФК с использованием рентгеновского дифрактометра «SHIMADZU XRD-600». Дифрактограммы исследовали в диапазоне углов 2θ от 10° до 45° при напряжении на трубке 40 кВ и токе 100 мА. Дифракционные пики определялись по литературным данным и базе данных ICDD (International Center for Diffraction Data. Power Diffraction File; 2 Campus Blvd: Newtown Square, PA, USA, 2007).

Инфракрасные (ИК) спектры ДКФД регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре Avatar 330 фирмы Nicolet (Англия) в диапазоне длин волн 4000–400 см^-1. Небольшое количество порошка смешивали с бромидом калия (1 мг порошка в 50 мг KBr спектроскопической чистоты) и прессовали в таблетку. Осадок анализировали в режиме пропускания в основном боксе при комнатной температуре. Инфракрасные данные для ДКФД собраны в таблице 2 и сравнены со спектром, полученным и представленным Петровым и др. при 300 и 77 К. Спектры практически совпадают с литературными данными для LRAL.

Качественный и количественный анализ элементного состава образцов проводился на рентгенофлуоресцентном волнодисперсионном спектрометре последовательного типа BRUKER S8 Tiger (серия 2) в гелии по бесстандартной методике с использованием программы QUANT-EXPRESS (Германия).

Культура клеток. Человеческие макрофаги получали из моноцитов периферической крови, выделенных из образцов периферической крови здоровых добровольцев с использованием набора MojoSort Human Pan Monocyte Isolation Kit (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Изолированные моноциты культивировали в среде RPMI/F12 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, США), 40 мкг/мл гентамицина (Gibco, США) при температуре 37 °C и 5% содержания CO₂ в CO₂-инкубаторе в течение 24 часов.

Для получения макрофагов выделенные моноциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 40 мкг/мл гентамицина сульфата при температуре 37 °C в с содержанием CO₂ в атмосфере 5%. Замену культуральной среды на свежую производили через три дня после посева клеток. Затем, через четыре дня, среду меняли на DMEM с добавлением 2% эмбриональной бычьей сыворотки. После 7 дней культивирования клеток в среде с низким содержанием эмбриональной бычьей сыворотки их использовали в экспериментах. Для открепления макрофагов от поверхности культурального пластика использовался коктейль аккутаз [25]. Макрофаги тестировали на наличие микоплазменной инфекции с помощью набора для обнаружения микоплазмы MycoFluor™ (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). В культурах клеток микоплазменная инфекция не была обнаружена.

Исследование цитотоксических свойств ДКФД и ДКФД-Ba. Клетки высевали в плотности 15*10³ клеток/см² на поверхность 96-луночного планшета (SPL Life Science, Pocheon, Южная Корея). Через 24 часа культивирования среду заменяли на 100 микролитров среды, содержащей различные концентрации кальций-фосфатных соединений. Образцы КФС предварительно стерилизовали 75% этанолом по указанной методике [26]. Для оценки цитотоксичности использовались следующие концентрации КФС: 10, 3, 1, 0.3, и 0,1 мг/мл. Клетки культивировали с КФС в течение 72 ч.

Цитотоксичность материалов оценивали с помощью проточного цитофлуориметра (BD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Клетки открепляли от культурального пластика и окрашивали их в суспензии в культуральной среде с использованием 200 нМ флуоресцентных красителей Calcein AM (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 1 мкг/мл йодида пропидия (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) [26-27].

Оценка содержания кислотных компартментов. Для оценки содержания кислотных компартментов в клетках после 96 ч совместной инкубации с ДКФД и ДКФД-Ba клетки промывали три раза фосфатно-солевым буфером (ФБС) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), открепляли от культурального пластика и окрашивали 50 нМ LysoTracker Green DND-26 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в течение 30 мин в условиях CO₂-инкубатора. В качестве положительного контроля часть клеток инкубировали с 50 мкМ хлорохином (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 4 ч. Измерения проводили с помощью проточного цитометра BD Accuri C6 (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Всего для каждого образца было проанализировано 3×10⁴ клеток.

Оценка продукции активных форм кислорода. Исследование влияния ДКФД и ДКФД-Ba на продукцию АФК в макрофагах проводили при стандартных условиях культивирования и при воспалительных условиях. Для изучения продукции АФК в воспалительных условиях макрофаги предварительно инкубировали с 10 мкг/мл ЛПС из E. coli O111: B4 в течение 24 часов. Для оценки продукции активных форм кислорода (ROS) в клетках после 72 ч совместной инкубации клеток с ДКФД и ДКФД-Ba клетки промывали три раза раствором ФБС, открепляли от культурального пластика и окрашивали 20 мкМ 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеин диацетатом (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 15 мин в условиях CO₂–инкубатора [28]. В качестве положительного контроля клетки инкубировали с 1 мМ перекисью водорода (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 20 мин. Измерения флуоресценции анализировали с помощью проточного цитометра BD Accuri C6. Для каждого образца анализировали 3×10⁴ клеток.

Статистический анализ. Результаты проведенного исследования представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Во всех экспериментах использовались статистические выборки с не менее чем 4 наблюдениями (n ≥ 4). Полученные данные были статистически проанализированы с использованием языка программирования Python 3 (версия 3.10.6) в среде разработки Spyder (версия 5.4.1) с использованием библиотек Pandas (версия 1.5.3), Numpy (версия 1.23.5) и Scipy (версия 1.10.0).

Перед проведением множественных сравнений данные предварительно тестировали на нормальность распределения и равенство дисперсий с использованием критериев Шапиро-Уилка и Брауна-Форсайта, соответственно. Далее проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим сравнением экспериментальных групп относительно контрольной с использованием теста Бонферрони. Различия считали статистически значимыми при p<0.05.

Результаты

Объекты исследования

Получение материалов на основе барий-замещенного ДКФД (ДКФД-Ва), реализовалось за счет фазового превращения исходного порошка альфа-трикальцийфосфата (α-ТКФ). Выдержка α-ТКФ проводилась в буферном растворе состава 1,5 М ацетата натрия, 0,15 М L-глутаминовой кислоты с добавлением нитрата бария в количестве, указанном в таблице 1, с доведенным до значения pH=5,5 ортофосфорной кислотой (раствор Аг 5,5), при соотношении масса образца/масса жидкости равным 1/100, в течении минимум 24 ч., при температуре подогрева 35±2 °С и постоянном перемешивании. Внедрение катионов Ba²⁺ в структуру ДКФД проводили на этапе трансформации ТКФ в ДКФД согласно предполагаемой реакции:

(1-X)Ca₃(PO₄)₂ + (1+2X)H₃PO₄ + 3XMe²⁺ + 2H₂O = 3Ca_(1-X)Me_XHPO₄*2H₂O+6XH⁺

 

Таблица 1. Расчетные массы добавок допирующих элементов необходимые для процесса с исходным порошком массой 10 г.

Table 1. The computed masses of doping element additions necessary for the process using an initial powder mass of 10 g.

 

Название	Сокращенное наименование	% теоретического замещения	mВа
ДКФД-допированный 1% Ba	ДКФД -Ba1	1	0,253
ДКФД-допированный 5% Ba	ДКФД -Ba5	5	1,265
ДКФД-допированный 10% Ba	ДКФД -Ba10	10	2,529

Основные результаты исследования

Результаты исследований порошков ДКФД, синтезированных в присутствии катионов бария в широком спектре концентраций, показали, что катионы бария не препятствуют процессу формирования структуры ДКФД. Результаты РФА с замещением 1, 5, 10 % теор. показали однофазный состав во всех выбранных концентрациях (рис.1), согласно карточке № 00-009-0077. Кристаллы ДКФД растут пропорционально основным плоскостям, а именно (021), (041) и (020). Рост кристаллов происходит преимущественно вдоль кристаллографической плоскости (020), о чем свидетельствует пик при 2θ = 11,7◦, структура моноклинная. ИК спектры образцов приведены на рис.2 и соответствуют данным по ДКФД из литературных источников (Табл. 2).

 

Таблица 2. Основные колебательные моды дигидрата дикальцийфосфата (ИК-Фурье спектроскопия)

Table 2. The main vibrational modes of dicalcium phosphate dihydrate (FTIR)

 

Волновое число(см−1)	Режимы колебаний
3541-3480	O—H растяжение молекул воды в решетке
2385, 1600—1720	Комбинация H—O—H изгиба и вращения остаточной свободной воды
1649 (тонкий)	H—O—H изгиб молекул воды в решетке
1219	P—O—H изгиб в плоскости
1135, 1059, 987	P—O растяжение
875	P—O(H) растяжение
791	P—O—H внеплоскостной изгиб
662	Либрации воды
576, 525	O—P—O(H) изгиб

 

Результаты исследований методом рентгенофлюоресцентного анализа (табл. 3) показали, что барий имеется в элементном составе во всех образцах. Так как фазовый состав порошков соответствовал 100 % ДКФД можно сделать вывод, что катионы бария встраиваются в структуру материала.

 

Таблица 3. Результаты рентгенофлюоресцентного элементного анализа ДКФД и ДКФД-Ва, aт.%.

Table 3. Results of X-ray fluorescence elemental analysis of DCF and DCFD-Va, at.%.

 

Образец	Са	Р	Ва	Са/Р	Са+Ва/Р
ДКФД-Ва 1 %	52,46 %	47,21 %	0,33 %	1,11	1,12
ДКФД-Ва 5 %	52,99 %	46,24 %	0,77 %	1,15	1,16
ДКФД-Ва 10 %	48,34 %	48,34%	3,32 %	1	1,07

 

Было рассчитано реальное (практическое) значение замещения кальция ионами бария ДКФД-Ва 1% теор. − 0,62 %; ДКФД-Ва 5% теор. – 1,43 %; ДКФД-Ва 10% теор. –6,43 %.

Были получены микрофотографии чистого порошка ДКФД и замещенных порошков ДКФД-Ва во всех вышеописанных концентрациях. Микроструктура образцов пластинчатая, с размерами от 10 до 50 мкм и соответствует микроструктуре ДКФД.

 

При исследовании жизнеспособности клеток в присутствии ДКФД и ДКФД-Ba через 72ч культивирования с макрофагами человека было выявлено, что ДКФД и ДКФД-Ba проявляют цитотоксический эффект при концентрациях 10 и 3 мг/мл (рис. 4). Начиная с концентрации 1 мг/мл исследованные материалы не оказывали цитотоксического эффекта. При этом различий в цитотоксическом действии между ДКФД и его Ba-замещенными вариантами не наблюдалось вне зависимости от степени замещения Ca²⁺ на Ba²⁺. Таким образом, замещение Ca²⁺ на Ba²⁺ в структуре ДКФД не оказывает влияние на его цитотоксические свойства. Для дальнейших исследований материалов использовали максимальную нетоксическую концентрацию 1 мг/мл.

При исследовании влияния кальций-фосфатов на содержание кислотных компартментов (лизосом и иных структур с низким рН) в клетках было обнаружено, что ДКФД и его Ba-замещенные варианты независимо от уровня замещения не оказывают воздействия на исследованный параметр (рис. 5).

Исследование продукции активных форма кислорода после 72 ч инкубации с ДКФД и ДКФД-Ba показало, что все исследованные КФС увеличивали продукцию активных форм кислорода в неактивированных липополисахаридом (ЛПС) макрофагах (рис. 6). При дополнительной активации макрофагов ЛПС наблюдалось снижение продукции АФК как у ДКФД, так и его Ba-замещенных вариантов по сравнению с контролем. При этом не наблюдалось отличий в продукции АФК между ДКФД и его Ba-замещенными вариантами, как у неактивированных, так и активированных макрофагов. Таким образом ДКФД и ДКФД-Ba способен снизать продукцию АФК в провоспалительных условиях in vitro.

Обсуждение

В последние годы иммунная регуляция репаративного остеогенеза не только стала устоявшейся догмой для современного материаловеденья, но и рассматривается как потенциальная терапевтическая стратегия [2-3, 7]. Важно понимать, что костная ткань – это не только опорный элемент скелета и депо двух самых главных ионов в организме – Ca²⁺ и PO₄^3-, обеспечивающих передачу большинства сигналов в организме и все процессы фософорилирования, но и часть иммунной системы [29-31]. Связь между иммунной системой, гомеостазом кости как органа и эффективностью регенерации костной ткани в случае повреждения привлекла внимание учёных из-за их теснейшего взаимодействия, обеспечивающего поддержание баланса между образованием новой костной ткани и её резорбцией, способствуя полноценности и целостности скелета [3]. При этом трудно недооценить важность ионов металлов в организме, обеспечивающих важнейшую роль в клеточной структуре, катализе, ферментативной функции, передаче сигналов, активации ионных каналов и сигнальных путей, а в последние годы все больше исследователей рассматривают их как регенеративные агенты для восстановления костной ткани [2-7, 11-16]. Было обнаружено, что высвобождение ионов металлов способствует интеграции имплантата и костной ткани за счет их взаимодействия с иммунными клетками в биологически безопасных концентрациях [3]. Другой важной парадигмой, которую переживает современное материаловеденье, является отказ от высокотемпературного (>600°C) синтеза кальций-фосфатной керамики и переход в область физиологических температур (<40°C) получения КФС-материалов, поскольку высокотемпературная керамика биоинертна и не обладает биоактивностью, следовательно не может стимулировать остеогенез [32], а также потому, что в норме в организме априори не может быть температуры свыше 40°C и, таким образом, получаемые материалы не могут быть гомологичны естественным участникам биоминерализации костной ткани [33-35].

В данной работе предпринята попытка получения естественного предшественника ГАп – дикальцийфосфат дигидрата, в условиях низкотемпературной химической трансформации с одновременным подходом легирования ДКФД ионами бария и проведена оценка стабильности структуры полученного соединения и его безопасности в условиях in vitro с центральным звеном иммунной системы, контактирующим с имплантами и определяющими их дальнейшую судьбу – макрофагами человека. Дополнительно, учитывая важность воспаления в регенеративном процессе [36-38], авторами дополнительно смоделированы воспалительные условия in vitro за счет ЛПС-активации макрофагов и оценено влияние полученных вариантов ДКФД-Ba на потенциальный провоспалительный эффект.

Полученные результаты показали состоятельность предложенного подхода низкотемпературного синтеза ДКФД и его Ва-замещенных вариантов; выявлено, что катионы бария не препятствуют формированию полноценной структуры эталонного ДКФД и катионы бария непосредственно встраиваются в структуру материала.

При исследований биосовместимости полученных материалов in vitro не обнаружено различий в цитотоксическом эффекте между ДКФД и его Ba-замещёнными вариантами независимо от степени замещения Ca²⁺ на Ba²⁺ что свидетельствует об отсутствии токсического влияния ионов бария на жизнеспособность клеток.

Важной характеристикой полученных материалов является отсутствие негативного влияния ДКФД и его Ва-замещенных вариантов на содержание кислотных компартментов (лизосом и других структур с низким рН), что потенциально свидетельствует о физиологическом характере возможной клеточной резорбции данных материалов при их имплантации в организм.

Еще одной важным показателем полученных низкотемпературных материалов является их вариабельное про- и антиоксидантное влияние на продукцию АФК макрофагами человека. Известно, что уровень воспаления играет важную роль в материал-ассоциированном остеогенезе, определяя либо естественный переход из воспалительной в пролиферативную и затем ремоделирующую стадии, либо пролонгируя воспалительную фазу, преходящую в хронический воспалительный процесс, заканчивающийся отторжением или фиброзной трансформацией [35-38]. В работе выявлено, что после 72 часов инкубации неактивированных макрофагов с ДКФД и его Ba-замещенными вариантами наблюдается увеличение продукции активных форм кислорода, в то время как инкубация этих же материалов с ЛПС-активированными макрофагами приводила к снижению продукции АФК. Таким образом, выявлено, что полученные КФС-материалы в нормальных условиях обладают прооксидантным, а в воспалительных – антиоксидантным действием, что может быть крайне полезным при разработке специализированных материалов, предназначенных для хирургического лечения воспаленных ран. При этом, выявленное отсутствие влияния на данный процесс непосредственно ионов бария в структуре материалов таже дополнительно свидетельствует о безопасности бария в качестве легирующего компонента.

Таким образом, можно предполагать, что предложенный подход низкотемпературного синтеза ДКФД и его Ba-замещенных вариантов является перспективным и может быть положен в основу получения КФС-материалов с дополнительными биоактивными свойствами.

 

Резюме основного результата исследования

Низкотемпературным методом были получены образцы дикальцийфосфат дигидрата, допированного катионами бария в концентрациях 1, 5. 10 % теор. Экспериментально рассчитаны практически полученные замещения кальция на барий – 0,62; 1,43 6,43 ат.%, соответственно. При 10 теор. ат .% наблюдается значительное увеличение количества Ba²⁺. Результаты рентгенофазового анализа показали полную трансформацию исходного α-ТКФ в ДКФД при всех вводимых концентрациях Ba²⁺. Результаты ИК-спектроскопии так же подтвердили полное соответствие ДКФД. Микроструктура полученных порошков показала соответствие структуре эталонного ДКФД при всех концентрациях. Было обнаружено, что допированный ионами Ba²⁺ ДКФД усиливает гидратационную активность, деформирует кристаллическую структуру, не оказывает токсического действия на клетки в физиологических концентрациях. не препятствует биогенезу рН-зависимых кислотных компартментов и оказывает специфическое про- и антиоксидантное действие в нормальных и воспалительных условиях соответственно, что делает его перспективным кандидатом для регенеративной медицины.

Обсуждение основного результата исследования

В работе предложен эффективный способ получения легированного барием ДКФД за счет низкотемпературного фазового превращения α-ТКФ. При теоретически рассчитанной концентрации бария в 10% наблюдается значительное увеличение фактического содержания Ba²⁺ в составе ДКФД до 6,43 ат.% что указывает на эффективность ионного замещения кальция в предшественниках ГАп, потенциально схожего с естественным процессом биоминерализации костной ткани в «зонах роста». Результаты комплексного физико-химического анализа подтвердили, что ДКФД соответствует эталонной структуре при всех используемых концентрациях Ba²⁺. Обнаружено, что легирование Ba²⁺ ДКФД позволяет управлять такими свойствами материала, как кристалличность и способность к гидратации, что крайне важно для придания материалам необходимых свойств биосовместимости и эффективности. В условиях in vitro выявлено, что замещение Ca²⁺ на Ba²⁺ в структуре ДКФД не влияет на его цитотоксические свойства, не подавляет биогенез лизосом в клетках, увеличивает продукцию активных форм кислорода (АФК) в неактивированных макрофагах, но подавляет продукцию АФК в этих клетках в воспалительных условиях, инициированных ЛПС-индукцией. Таким образом, как сам низкотемпературный ДКФД, так и его варианты с различной степенью замещения Ba²⁺ являются перспективными КФС для использования в составе специализированных остеопластических материалов.

Ограничения исследования

Для полного понимания потенциала ДКФД и его Ba-замещенных вариантов необходимы дальнейшие исследования, учитывающие взаимодействие материалов с тканями периимплантного ложа и всем спектром остеогенных и иммунных клеток, однако первые полученные результаты можно отнести к многообещающим. Полученные результаты указывают на то, что ионы бария могут повышать биоактивность низкотемпературных КФС-материалов, потенциально способствуя регенерации костной ткани и снижая риск отторжения имплантатов. При этом, несмотря на первые робкие успехи, истинный регенеративный потенциал и безопасность предложенных материалов будут выявлены в моделях гетеротопической и ортотопической имплантации в полном соответствии как с требованиями ISO 10993, так и специализированных рекомендаций ASTM.

Заключение

Предложенный подход низкотемпературного синтеза Ba2+-замещенных вариантов ДКФД перспективен и представляет интерес для получения специализированных остеопластических КФС-материалов. Полученные Ba2+-замещенные варианты ДКФД не обладают цитотоксическим свойствами в концентрации 1 мг/мл, т.е. в максимально приемлемой для имплантации дозе. При этом наиболее эффективный вариант ДКФД с максимальной степенью замещения Ca2+ на Ba2+ в 6,43 ат.% является обладает потенциальным регуляторным действием на активированные макрофаги (т.е. в воспалительных условиях), что может быть крайне важным свойством для регуляции иммунной реакции и остеоинтеграции материала в организме реципиента.

 

 

Дополнительная информация

Источник финансирования. Публикация настоящей работы поддержана Российским научным фондом, проект № 21-73-20251 «Влияние структурных и фазовых трансформаций кальцийфосфатных соединений на механизмы биоинтеграции или отторжения материалов, предназначенных для регенерации костной ткани».

Funding source. This work was supported by the Russian Science Foundation, project #21-73-20251 «Influence of structural and phase transformations of calcium phosphate compounds on the mechanisms of biointegration or rejection of materials intended for bone tissue regeneration».

Информированное согласие на участие в исследовании. Все участники исследования до включения в исследование добровольно подписали форму информированного согласия, утвержденную в составе протокола исследования этическим комитетом.

Patients’ consent. Written consent was obtained from all the study participants before the study screening in according to the study protocol approved by the local ethic committee.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов: И.В. Смирнов — разработка технологии низкотемпературной химической трансформации, синтез материалов, исследование физико-химических характеристик материалов; П.В. Смирнова — обработка первичных данных, визуализация, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; Тетерина А.Ю. — разработка концепции исследования, разработка технологии допирования материалов, написание и редактирование текста статьи; В.В. Минайчев, М.И. Кобякова, Салынкин П.С., Пятина К.В., Мещерякова Е.И. — проведение in vitro исследований, обработка данных, визуализация, статистическая обработка данных, редактирование текста статьи; И.С. Фадеева — разработка концепции исследования, обработка данных, сбор и анализ литературных источников, написание и редактирование текста статьи; С.М. Баринов, В.С. Комлев — концептуализация, методология, руководство, рецензирование и редактирование текста статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution: I.V. Smirnov — design of low-temperature chemical transformation technology, synthesis of materials, study of physical and chemical characteristics of materials; P.V. Smirnova — processing of primary data, visualization, writing the text of the article; collection and analysis of literary sources, preparation of the text and editing of the article; Teterina A.Yu. — development of the research concept, development of technology for doping materials, preparation and writing of the text of the article; V.V. Minaichev, M.I. Kobyakova, P.S. Salynkin, K.V. Pyatina, E.I. Meshcheryakova — in vitro research, data processing, visualization, statistical data processing, editing of the text of the article; I.S. Fadeeva — development of the research concept, data processing, collection and analysis of literary sources, writing and editing the text of the article; S.M. Barinov, V.S. Komlev — conceptualization, methodology, guidance, review and editing of the text of the article. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

Благодарности. Авторы выражают свою признательность Центрам коллективного пользования исследовательским оборудованием ИТЭБ РАН и ИМЕТ РАН.

Acknowledgments. The authors extend their appreciation to the Centers for the collective use of research equipment of ITEB RAS and IMET RAS.

 

 

About the authors

Polina Viktorovna Smirnova

Baikov institute of metallurgy and materials science, Russian academy of sciences

Email: smirnova-imet@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5437-7052
SPIN-code: 5022-2890
Scopus Author ID: 58096448400

младший научный сотрудник, Лаборатория керамических композиционных материалов № 20

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49

Anasia Yurievna Teterina

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук

Email: teterina_imet@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-1405-2607
SPIN-code: 5514-8643
Scopus Author ID: 25959438600

кандидат технических наук, научный сотрудник, лаборатория № 20

Russian Federation, 119334, ГОРОД МОСКВА, ПР-КТ ЛЕНИНСКИЙ, Д. 49

Igor Valerievich Smirnov

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук, Москва, Россия

Email: baldyriz@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3602-0276
SPIN-code: 3680-5330
Scopus Author ID: 56677332800

младший научный сотрудник, Лаборатория № 20

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49

Vladislav Valentinovich Minaychev

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук,Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Email: vminaychev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8498-4566
SPIN-code: 9217-1374
Scopus Author ID: 57202095976

кандидат биологических наук, научный сотрудник

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49 ; 142290, Россия, Пущино, Институтская ул, 3

Pavel Sergeevich Salynkin

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Email: salynkin.p.s@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-0959-8072
SPIN-code: 2594-8099

младший научный сотрудник

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49 ; 142290, Россия, Пущино, Институтская ул, 3

Margarita Igorevna Kobyakova

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Email: kobyakovami@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6846-9994
SPIN-code: 5611-8437

научный сотрудник

Russian Federation, 142290, Россия, Пущино, Институтская ул, 3

Kira Vadimovna Pyatina

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наукФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Email: kirapyatina01@gmail.com
ORCID iD: 0009-0003-0194-6922
SPIN-code: 2935-4432

младший научный сотрудник

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49 ; 142290, Россия, Пущино, Институтская ул, 3

Elena Ivanovna Meshcheriakova

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Email: elena.mesh2311@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-6148-5211
SPIN-code: 6332-6772

старший научный сотрудник

Russian Federation, 142290, Россия, Пущино, Институтская ул, 3

Irina Sergeevna Fadeeva

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Email: fadeeva.iteb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1709-9970
SPIN-code: 6475-1023
Scopus Author ID: 36128338400

заведующий лаборатории, ведущий научный сотрудник

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49 ; 142290, Россия, Пущино, Институтская ул, 3

Sergey Mironovich Barinov

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук

Email: barinov_s@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4544-2817
SPIN-code: 5876-1906
Scopus Author ID: 7004365385

главный научный сотрудник

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49

Vladimir Sergeevich Komlev

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук

Author for correspondence.
Email: komlev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2068-7746
SPIN-code: 2668-0066
Scopus Author ID: 7004654067

чл.-корр. РАН, доктор технических наук, директор ИМЕТ РАН

Russian Federation, 119334, Россия, Москва, Ленинский пр-т, 49

References

Supplementary files