РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПОФУСЦИНА В КОРЕ МОЗЖЕЧКА ЧЕЛОВЕКА



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Липофусцин является общепризнанным внутриклеточным маркером старения. Цель настоящего исследования состояла в установлении топографических особенностей распределения скоплений гранул липофусцина в коре мозжечка. Пигмент выявляли, используя его свойство автофлюоресцировать, на срезах коры мозжечка у людей (n=25, возраст 20-89 лет) с помощью флюоресцентной микроскопии. Анализ препаратов показал наличие в различных слоях коры мозжечка гранул липофусцина, обладающих преимущественно желто-зеленой автофлюоресценцией. Выявлено, что с возрастом появляется тенденция к увеличению количества этих гранул и их размеров. Обнаружено, что липофусцин накапливается в слоях коры мозжечка неравномерно - заметнее в клетках Пуркинье; при этом с возрастом происходит изменение локализации липофусцина - от перинуклеарного к месту отхождения отростков.

Полный текст

Мозжечок является центральной структурой головного мозга, ответственной за двигательную активность и когнитивные навыки [12-14]. Известно, что с возрастом происходят нарушения этих важнейших функций, которые сопровождаются гибелью клеток [4, 5, 11], а потому данные о структурных изменениях, происходящих в мозжечке при старении, представляют исключительный интерес. На протяжении многих лет одним из важнейших морфологических признаков старения клеток человека считается накопление в их цитоплазме гранул липофусцина [15]. Этот липопигмент, впервые описанный Р. Вирховым еще в 1847 г., до настоящего времени привлекает внимание многих исследователей, так как сохраняются противоречия в данных о химическом составе, источниках и механизмах его образования, неоднозначны и сведения о роли липофусцина в процессах внутриклеточного обмена. Наличие незначительного числа исследований липофусцина, выполненных на мозжечке человека с помощью современных методических подходов, отсутствие системного анализа как в возрастном аспекте, так и при патологии, обусловливают необходимость проведения дальнейших исследований накопления этого пигмента в нейронах головного мозга человека. Цель настоящего исследования - установление топографических особенностей распределения скоплений гранул липофусцина в коре мозжечка человека. Материал и методы. В работе использованы блоки с фрагментами коры мозжечка человека (n=25, возраст 20-89 лет) из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины. Причиной смерти были: черепно-мозговая травма различной давности (от 6 сут до 3,5 мес, n=13), сердечно-сосудистые заболевания (n=6), острая массивная кровопотеря (n=4), другие причины (n=2). Материал был фиксирован в цинк-этанол-формальдегиде [2], обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из полученных блоков готовили срезы толщиной 7 мкм. Для лучшей ориентации в структурах коры мозжечка срезы докрашивали ядерным флюоресцентным красителем 4΄,6-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлоридом (DAPI) в разведении 1:100 из набора SelectFX® Nuclear Labeling Kit (Invitrogen, США). Препараты исследовали под микроскопом Leica DM2500, оснащенным системой фильтров флюоресценции от 340 до 560 нм; фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры Leica DFC420 (Германия). В комплект блок-системы фильтров входили: возбуждающий фильтр ВР=340-380 нм (первый - «А»); возбуждающий фильтр ВР=450-490 нм (второй - «I3»); возбуждающий фильтр ВР=515-560 нм (третий - «N2,1»). Изображения получали путем совмещения исходных фотографий, снятых при использовании первого («А») и второго («I3») фильтров с подавлением фоновой автофлюоресценции в зеленом диапазоне видимого света. Измерение гранул липофусцина проводили с использованием программы LASEZ (Leica, Германия). Для подтверждения принадлежности регистрируемой автофлюоресценции липофусцину проводили контрольную окраску суданом черным (Chemapol, Чехия) по Герксгеймеру [3]. Корреляцию между возрастом и количеством липофусцина (выраженном в баллах) определяли с помощью вычисления коэффициента корреляции, используя программы BioStat Professional 2009 (США), различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Анализ препаратов, исследованных с применением всех трех фильтров, показал наличие в различных слоях коры мозжечка гранул, обладающих преимущественно желто-зеленой автофлюоресценцией (рисунок), размером 0,3-1,7 мкм. При этом свечение окрашенных DAPI ядер клеток наблюдалось только в сине-фиолетовом диапазоне видимого света. Окраска препаратов суданом черным выявила подавление автофлюоресценции обнаруженных гранул. В срезах головного мозга у людей молодого возраста эти гранулы встречались редко. Они располагались небольшими скоплениями на границе молекулярного слоя и слоя клеток Пуркинье (КП), в периваскулярных клетках около мелких кровеносных сосудов в зернистом слое и белом веществе, в единичных КП в виде мелкогранулярных скоплений в перинуклеарной части цитоплазмы. С возрастом была обнаружена тенденция к увеличению количества этих гранул и их размеров (r=0,97, P<0,05). Они располагались диффузно в виде многочисленных крупных скоплений в зернистом слое, на границе молекулярного и слоя КП, в белом веществе как периваскулярно, так и между нервными волокнами. Практически во всех КП они заполняли бóльшую часть перинуклеарной цитоплазмы, а также зачастую обнаруживались у мест отхождения отростков. При этом светло-желтая автофлюоресценция пигмента у людей старшего возраста приобретала оранжево-желтую окраску. Обсуждение полученных данных. Проведение флюоресцентной микроскопии позволило установить, что обнаруженные в различных слоях коры мозжечка гранулы состоят из липофусцина, поскольку они обладают автофлюоресценцией, индуцируемой как ультрафиолетовой, так и коротковолновой частью видимого света. Несмотря на то, что автофлюоресценция регистрируется в большей части видимого диапазона, максимальная флюоресценция отмечается в желто-зеленой части спектра. Широта спектра эмиссии, а также большая интенсивность излучения в желтой области видимого света подтверждают, что эти гранулы являются липофусцином, а не формалиновым пигментом, меланином или гемосидерином, которые не обладают подобной автофлюоресценцией [7]. Результаты окраски суданом черным показали, что автофлюоресценция после окраски подавляется. Этот факт свидетельствует о липофильности выявляемого пигмента, которая свойственна именно липофусцину. В ходе настоящего исследования обнаружено, что липофусцин накапливается в слоях коры мозжечка неравномерно, что, скорее всего, связано с функциональными и метаболическими особенностями различных клеточных популяций данной структуры головного мозга. При этом наиболее заметным оказалось накопление липофусцина с возрастом в КП, что можно объяснить высоким уровнем энергетического обмена, характерного для этих клеток [6]. При проведении данного исследования не была обнаружена зависимость накопления липофусцина от причины смерти (в том числе и в результате черепно-мозговой травмы). Однако во всех исследованных случаях сохранялась возрастная зависимость накопления липофусцина. При этом существенное увеличение количества липофусцина в коре мозжечка происходит в период 45-50 лет. Примененный в настоящей работе способ выявления липофусцина не позволил достоверно определить типовую принадлежность большинства содержащих его клеток (за исключением КП). Вместе с тем, отчетливое идентифицируемые морфологические особенности ядер и расположение этих клеток свидетельствуют о том, что основная часть из них - глиоциты. Высокое содержание липофусцина в глиальных клетках (микроглиоцитах и астроцитах) может свидетельствовать об их непосредственном участии в катаболизме пигмента, освобождаемого из гибнущих нейронов [9]. Очевидно, что внутриклеточное накопление липофусцина играет большую роль в механизмах старения нервной системы, поскольку скопление больших количеств этого пигмента наносит ощутимый ущерб клетке, оттесняя цитоплазматические органеллы, ухудшая или блокируя диффузионные и транспортные процессы, снижая эффективность метаболизма [8, 10]. В частности, изменение локализации липофусцина с возрастом - от перинуклеарного к полярному расположению в дендритах и аксонных холмиках, а также скопление здесь больших его количеств - затрудняет внутриклеточный транспорт, приводя в итоге к дегенерации и утрате клеточных отростков, что может являться одним из механизмов потери значительного числа КП при старении [1, 16]. Таким образом, настоящее исследование позволило получить новые данные о распределении липофусцина в коре мозжечка человека и подтвердить связь накопления этого пигмента с возрастом. Обнаруженное изменение цвета автофлюоресценции липофусцина у людей старшей возрастной группы требует уточнения с использованием других методических подходов.
×

Об авторах

Елена Геннадьевна Сухорукова

Институт экспериментальной медицины

Email: len48@inbox.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Елена Георгиевна Гилерович

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Марина Александровна Сырцова

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Анастасия Дмитриевна Новикова

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: dek2@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

  1. Гилерович Е. Г., Федорова Е. А., Григорьев И. П., Коржевский Д. Э. Морфологические основы реорганизации коры мозжечка крыс при старении // Журн. эвол. биохим. 2015. Т. 15, № 5. С. 370-376.
  2. Коржевский Д. Э., Сухорукова Е. Г., Гилерович Е. Г. и др. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. 2013. Т. 143, вып. 2. С. 81-85.
  3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969.
  4. Bennett I. J., Madden D. J. Disconnected aging: cerebral white matter integrity and age-related differences in cognition // Neuroscience. 2014. Vol. 276. P. 187-205.
  5. Bernard J. A., Seidler R. D. Moving forward: age effects on the cere bellum underlie cognitive and motor declines // Neurosci. Biobehav. Rev. 2014. № 42. P. 193-207.
  6. Bertoni-Freddari C., Fattoretti P., Giorgetti B. et al. Decay of mitochondrial metabolic competence in the aging cerebellum // Ann N Y Acad. Sci. 2004. Vol. 1019. P. 29-32.
  7. Brizzee K. R., Cancilla P.A., Sherwood N., Timiras P.S. The amount and distribution of pigments in neurons and glia of the ce rebral cortex. Autofluorescent and ultrastructural studies // J. Gerontol. 1969. Vol. 24, № 2. P. 127-135.
  8. Brunk U. T., Terman A. Lipofuscin: mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function // Free Radic. Biol. Med. 2002. Vol. 33, № 5. P. 611-619.
  9. Glees P., Aloj Totaro E., Pisanti F. Possible removal route of osmiophilic material (lipofuscin) from spinal ganglia of Torpedo marmorata // J. Hirnforsch. 1986. Vol. 27, № 1. P. 79-86.
  10. Goyal V. K. Lipofuscin pigment accumulation in human brain during aging // Exp. Gerontol. 1982. Vol. 17, № 6. P. 481-487.
  11. Koppelmans V., Hirsiger S., Mйrillat S. et al. Cerebellar gray and white matter volume and their relation with age and manual motor performance in healthy older adults // Hum. Brain Mapp. 2015. Vol. 36, № 6. P. 2352-2363.
  12. Koziol L. F., Budding D., Andreasen N. et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition // Cerebellum. 2014. Vol. 13, № 1. P. 151-177.
  13. Manto M., Bower J. M., Conforto A. B. et al. Consensus paper: roles of the cerebellum in motor control - the diversity of ideas on cerebellar involvement in movement // Cerebellum. 2012. Vol. 11, № 2. P. 457-487.
  14. Schmahmann J. D., Caplan D. Cognition, emotion and the cerebellum // Brain. 2006. Vol. 129, № 2. P. 290-292.
  15. Terman A., Brunk U. T. Lipofuscin // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36, № 8. P. 1400-1404.
  16. Zhang C., Zhu Q., Hua T. Aging of cerebellar Purkinje cells // Cell Tissue Res. 2010. Vol. 341, № 3. P. 341-347.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 2016


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.