ЭКСПРЕССИЯ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-2 В МИОКАРДЕ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ АНТРАЦИКЛИНОВОЙ КАРДИОМИОПАТИИ

Полный текст

Цитотоксические эффекты многих противоопухолевых препаратов представляют не менее серьезную проблему для клинической практики, чем неопластический процесс, поскольку могут вызывать развитие как острых, так и хронических структурно-функциональных нарушений органов и тканей, не поврежденных опухолевым процессом, что в ряде случаев может приводить к развитию кардиомиопатии и летальному исходу, например, при использовании антрациклиновых антибиотиков [2, 17]. Одним из наиболее эффективных препаратов этой группы является доксорубицин, который по спектру своего действия на внутриклеточные структуры и макромолекулы кардиомиоцитов относится к плейотропным препаратам [1, 17]. Несмотря на большое количество исследований, касающихся молекулярных механизмов повреждения и гибели кардиомиоцитов при действии антрациклиновых антибиотиков, особенно доксорубицина, механизмы протеолиза структурных белков кардиомиоцитов, например, входящих в состав саркомеров, митохондрий или ядерных белков, стали детально проясняться лишь в последнее время. Установлено, в частности, что значительную роль в процессах внутриклеточного протеолиза, ассоциированного с развитием сердечной недостаточности (дисфункции), играют матриксные металлопротеиназы (ММП), в том числе матриксная металлопротеиназа-2 (ММП- 2, желатиназа), которая выявлена не только во внеклеточном матриксе, но и в ядрах и саркоплазме кардиомиоцитов [6, 13]. Экспрессия ММП-2 в кардиомиоцитах обнаружена в саркомерах миофибриллярных пучков не только при развитии патологических процессов (окислительном стрессе), но и в физиологических условиях (например, кардиомиогенезе, пролиферации кардиомиоцитов) [4, 10]. Оценка характера и выраженности экспрессии ММП-2 в кардиомиоцитах при моделировании хронической антрациклиновой кардиомиопатии и сопоставление полученных данных с выраженностью деструктивных процессов и ремоделирования миокарда способствуют разработке критериев повреждения миокарда при патологических состояниях, а также уточнению механизмов ремоделирования кардиомиоцитов и отдельных их компартментов. Цель данного исследования - изучить характер и распространенность экспрессии ММП-2 в кардиомиоцитах у крыс в динамике развития антрациклиновой кардиомиопатии. Материал и методы. Антрациклиновую кардиомиопатию моделировали у крыс-самцов линии Вистар (n=28), которым однократно внутрибрюшинно вводили доксорубицина гидрохлорид (ДОК) (Фармахеми Б. В., Нидерланды) в дозе 7 мг/кг в растворе 0,9% NaCl. Контрольным животным (n=5) одновременно с подопытными внутрибрюшинно однократно вводили изотонический раствор хлорида натрия в объеме, соответствующем массе их тела. Всех животных содержали в стандартных условиях вивария на полноценном рационе, вода ad libitum. Эксперименты проведены с соблюдением всех правил и рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Животных выводили из эксперимента декапитацией в первой половине дня через 3 и 14 сут после введения ДОК. После вскрытия животного и взвешивания сердца образцы миокарда фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином - эозином с постановкой реакции Перлса, по методу ван Гизона с докраской эластических волокон резорцин-фуксином по Вейгерту, ставили ШИК-реакцию. Экспрессию ММП-2 в миокарде оценивали с помощью метода иммуногистохимии. Использовали первичные поликлональные кроличьи антитела к ММП-2 в разведении 1:100 (Е18012, SpringBioscience, США). В качестве хромогена применяли 3,3’-диаминобензидин, срезы докрашивали гематоксилином и исследовали с помощью универсального микроскопа Leica DM 4000B (Leica, Германия). Используя планиметрический подход и компьютерную программу «Leica QWinV3», оценивали объемную плотность кардиомиоцитов с литическими повреждениями (при ув. 400, тестовая площадь была 61 171,56 мкм2). Проводили измерения площадей сечения кардиомиоцитов и относили к тестовой площади; для каждого животного анализировали не менее 30 неперекрывающихся полей зрения. С помощью компьютерной программы «Leica QWinV3» проводили подсчет ММР-2-позитивных ядер кардиомиоцитов при ув. 1000 (тестовая площадь - 9395,54 мкм2). Для каждого животного подсчет ядер кардиомиоцитов проводили на 20 непересекающихся тестовых площадях. Затем вычисляли индекс ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов. Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента, различия считали значимыми при P<0,05. Взаимосвязь разных морфометрических параметров оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Результаты исследования. Миокард контрольных животных был представлен в основном плотно расположенными мышечными волокнами, между которыми находились тонкие прослойки соединительной ткани и кровеносные сосуды. В миокарде у контрольных крыс встречались единичные кардиомиоциты с эозинофильной саркоплазмой (контрактурные повреждения преимущественно I и II степени) и кардиомиоциты с разреженной (лизированной) саркоплазмой (объемная плотность таких кардиомиоцитов составляла 3,5±0,7%). В миокарде контрольных животных ММП-2 выявлялась преимущественно в ядрах кардиомиоцитов. При этом интенсивность окрашивания была умеренной, индекс ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов составлял 29±5%. Через 3 сут после введения доксорубицина в миокарде наблюдали кардиомиоциты с различной интенсивностью окрашивания саркоплазмы эозином. Регистрировались отдельные кардиомиоциты или их небольшие группы с контрактурными повреждениями миофибрилл (эозинофильные сегменты), преимущественно II и III степени. В то же время, во всем миокарде присутствовали кардиомиоциты с признаками лизиса саркоплазмы, объемная плотность таких клеток возрастала в 5,4 раза (до 18,8±2,2%, P<0,001). Кардиомиоциты с контрактурными и литическими изменениями располагались среди клеток с нормальным строением и неизмененными тинкториальными свойствами. Следует отметить полиморфизм ядер кардиомиоцитов (увеличение их размеров, изменения формы и тинкториальных характеристик) и частое их смещение в подсарколеммальную зону. Нарушения гемодинамики проявлялись венозным и капиллярным полнокровием, лимфостазом, умеренным отеком. В этот срок эксперимента в миокарде возрастало количество кардиомиоцитов с ММП-2позитивными ядрами, усиливалась интенсивность их окрашивания (рисунок, а). Индекс ММП-2позитивных ядер кардиомиоцитов возрастал в 2,1 раза (до 60,4±1,9%, P<0,001). Одновременно в саркоплазме кардиомиоцитов начинала выявляться ММП-2-позитивная зернистость (см. рисунок, а). При этом следует особо отметить, что в саркоплазме кардиомиоцитов с контрактурными повреждениями миофибрилл ММП-2 не выявлялась ни в ядрах, ни в саркоплазме (см. рисунок, б). В кардиомиоцитах с субсегментарными контрактурами ММП-2 локализовалась в участках саркоплазмы, расположенных между полосами сокращения. Через 14 сут после однократного введения сублетальной дозы доксорубицина в миокарде усиливались деструктивные изменения, в 6,2 раза возрастала объемная плотность расположения кардиомиоцитов с литическими повреждениями (до 21,6±1,3%, P<0,001). Повсеместно встречались очаги некробиоза кардиомиоцитов, инфильтрированные мононуклеарными клетками, отмечалось их укрупнение. Сохранялись гемодинамические расстройства, происходило развитие диффузного кардиосклероза. В этот срок эксперимента локализация ММП-2 в кардиомиоцитах существенно не изменялась, но возрастала интенсивность окрашивания саркоплазмы кардиомиоцитов (см. рисунок, в). В кардиомиоцитах с контрактурными повреждениями ММП-2 не выявлялась (см. рисунок, г). В этот срок эксперимента еще в большей степени (в 2,6 раза по сравнению с контролем) возрастал индекс ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов (до 74,7±0,4%, P<0,001). Значительное увеличение ММП-2-позитивных ядер коррелировало с возрастанием объемной плотности кардиомиоцитов с литическими повреждениями саркоплазмы (r=0,942, P<0,05). Обсуждение полученных данных. Активацию ММП традиционно связывают с ремоделированием внеклеточного матрикса в разных органах и тканевых системах в физиологических условиях и при развитии широкого спектра патологических процессов [16]. В отношении миокарда эти процессы наиболее детально изучены при ишемических состояниях (в том числе, инфаркте миокарда), гипертрофии левого желудочка (преимущественно в результате гипертензивных состояний разного генеза), вирусных миокардитах и некоторых видах кардиомиопатий [9, 18]. Ремоделирование внеклеточного матрикса является одной из составляющих ремоделирования миокарда, в который вовлечены также все его клеточные популяции, в наибольшей степени кардиомиоциты, и сосудистое русло. Важно отметить, что многокомпонентный внеклеточный матрикс имеет структурно-функциональное значение, заключающееся в организации и регуляции жизнедеятельности кардиомиоцитов, процессов их регенерации, гибели и элиминации. Поэтому большое количество исследований посвящены изучению активации и ингибированию ММП во внеклеточном матриксе при очаговых и диффузных патологических процессах с целью поиска молекулярных мишеней и разработки фармакологических подходов для снижения фибропластических процессов и стимуляции пролиферативных реакций кардиомиоцитов. Обнаружение внутриклеточных локализаций ММП-2 в клетках миокарда, в том числе и в кардиомиоцитах, и ее активация при развитии окислительного стресса в условиях ишемии-реперфузии миокарда и действии провоспалительных цитокинов [8, 11, 14] положили начало новому направлению в изучении физиологической роли этой протеазы - выяснению протеолитической активности в отношении структурных белков (ядерных и саркоплазматических) кардиомиоцитов как молекулярной основы развития сердечной дисфункции. С помощью различных методических подходов установлено, что ММП-2 локализуется в саркомерах вблизи регуляторного белка тропонина I [4], легкой цепи-1 миозина, белков цитоскелета α-актинина и десмина [19], ядерных белков (ферментов, участвующих в репарации ДНК и др.) [6], в протеолизе которых ММП-2 принимает участие. Осуществляя протеолитическое расщепление ряда саркоплазматических и ядерных белков, ММП-2 играет важную роль в ремоделировании внутриклеточных структур, их деструкции и инициации, таким образом, процессов внутриклеточной регенерации (репарации) или гибели кардиомиоцитов. Ингибирование ММП-2 с помощью доксициклина или о-фенантролина снижает или предотвращает протеолитическое расщепление упомянутых выше белков при окислительном стрессе кардиомиоцитов, вызванном разными причинами [14]. Усиление активности ММП-2 в плазме крови и миокарде после введения мелким грызунам больших доз доксорубицина (15-25 мг/кг) было установлено с помощью биохимических методов и зимографии [7, 12]. Усиление активности ММП-2 в этих случаях сопровождалось увеличением активности Akt-киназы, ингибированием супероксиддисмутазы, повышением продукции супероксида и оксида азота. Эти данные указывают на то, что активация ММП-2 в миокарде при антрациклиновых повреждениях обусловлена преимущественно развитием окислительного стресса и снижением антиоксидантной защиты. В нашем исследовании с помощью иммуногистохимического анализа ММП-2 была выявлена преимущественно в ядрах кардиомиоцитов как у контрольных, так и у подопытных крыс, подвергнутых однократному воздействию сублетальной дозы (7 мг/кг) доксорубицина. Развитие антрациклиновой кардиомиопатии, усиление литических повреждений кардиомиоцитов сопровождалось увеличением в 2,6 раза индекса MMП2-позитивных ядер кардиомиоцитов и появлением продуктов иммуногистохимической реакции в их саркоплазме. При этом мы не обнаружили ММП- 2-позитивного окрашивания стромы миокарда во все сроки эксперимента. Подобные результаты были получены при моделировании хронической даунорубицин-и доксорубицининдуцированной кардиомиопатии у кроликов - иммуногистохимически ММП-2 выявлялась в кардиомиоцитах и фибробластах, но не во внеклеточном матриксе [3, 5]. Присутствие ММП-2 в ядрах кардиомиоцитов у контрольных животных и увеличение ее экспрессии при действии антрациклиновых антибиотиков, индуцирующих усиленную генерацию активных форм кислорода [17], свидетельствуют о том, что ММП-2 относится к конститутивным формам ядерных белков, экспрессия которых значительно возрастает при цитопатических воздействиях. Возрастание экспрессии ММП-2 безусловно связано с усилением протеолитического расщепления ядерных белков (например, ламина А, поли-АДФ-рибозаполимеразы) [6, 15], что можно отнести к механизмам повреждающего действия. В то же время, присутствие ММП-2 в ядрах кардиомиоцитов в норме позволяет сделать вывод, что эта протеиназа играет важную роль в процессах клеточного роста, клеточном цикле, возможно полиплоидизации, при которых ремоделирование нуклеоплазмы имеет большое значение. Выявление сильной положительной корреляционной связи между объемной плотностью кардиомиоцитов с литическими изменениями саркоплазмы и индексом MMП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов свидетельствует о важной роли данной металлопротеиназы в доксорубицининдуцированных повреждениях кардиомиоцитов. Поскольку по мере развития антрациклиновой кардиомиопатии происходило не только увеличение индекса MMП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов, но и усиление интенсивности окрашивания саркоплазмы при постановке иммуногистохимической реакции и нарастание деструктивных процессов в кардиомиоцитах, можно рассматривать индекс MMП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов в качестве дополнительного критерия выраженности цитотоксического эффекта доксорубицина (и подобных ему химических соединений). Таким образом, ММП-2 в миокарде у контрольных крыс и крыс, подвергнутых воздействию сублетальной дозы доксорубицина, экспрессируется преимущественно в ядрах кардиомиоцитов. По мере развития антрациклиновой кардиомиопатии ММП-2 начинает выявляться в саркоплазме кардиомиоцитов. При этом в контрактурно измененных кардиомиоцитах ММП-2 не регистрируется. Выявлена положительная корреляционная связь между объемной плотностью кардиомиоцитов с литическими повреждениями саркоплазмы и индексом ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ММП-2 может вносить вклад в развитие литических изменений кардиомиоцитов и обусловливать их последующую деструкцию.

Об авторах

Елена Леонидовна Лушникова

Институт молекулярной патологии и патоморфологии

Email: pathol@inbox.ru
лаборатория цитологии и клеточной биологии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Дмитрий Борисович Никитюк

Институт молекулярной патологии и патоморфологии

лаборатория цитологии и клеточной биологии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Марина Геннадьевна Клинникова

Институт молекулярной патологии и патоморфологии

лаборатория цитологии и клеточной биологии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Елена Владимировна Колдышева

Институт молекулярной патологии и патоморфологии

лаборатория цитологии и клеточной биологии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Марина Маратовна Мжельская

Институт молекулярной патологии и патоморфологии

лаборатория цитологии и клеточной биологии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Список литературы

Дополнительные файлы