EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE-2 IN THE MYOCARDIUM IN THE EXPERIMENTAL MODEL OF ANTHRACYCLINE CARDIOMYOPATHY

Full Text

Цитотоксические эффекты многих противоопухолевых препаратов представляют не менее серьезную проблему для клинической практики, чем неопластический процесс, поскольку могут вызывать развитие как острых, так и хронических структурно-функциональных нарушений органов и тканей, не поврежденных опухолевым процессом, что в ряде случаев может приводить к развитию кардиомиопатии и летальному исходу, например, при использовании антрациклиновых антибиотиков [2, 17]. Одним из наиболее эффективных препаратов этой группы является доксорубицин, который по спектру своего действия на внутриклеточные структуры и макромолекулы кардиомиоцитов относится к плейотропным препаратам [1, 17]. Несмотря на большое количество исследований, касающихся молекулярных механизмов повреждения и гибели кардиомиоцитов при действии антрациклиновых антибиотиков, особенно доксорубицина, механизмы протеолиза структурных белков кардиомиоцитов, например, входящих в состав саркомеров, митохондрий или ядерных белков, стали детально проясняться лишь в последнее время. Установлено, в частности, что значительную роль в процессах внутриклеточного протеолиза, ассоциированного с развитием сердечной недостаточности (дисфункции), играют матриксные металлопротеиназы (ММП), в том числе матриксная металлопротеиназа-2 (ММП- 2, желатиназа), которая выявлена не только во внеклеточном матриксе, но и в ядрах и саркоплазме кардиомиоцитов [6, 13]. Экспрессия ММП-2 в кардиомиоцитах обнаружена в саркомерах миофибриллярных пучков не только при развитии патологических процессов (окислительном стрессе), но и в физиологических условиях (например, кардиомиогенезе, пролиферации кардиомиоцитов) [4, 10]. Оценка характера и выраженности экспрессии ММП-2 в кардиомиоцитах при моделировании хронической антрациклиновой кардиомиопатии и сопоставление полученных данных с выраженностью деструктивных процессов и ремоделирования миокарда способствуют разработке критериев повреждения миокарда при патологических состояниях, а также уточнению механизмов ремоделирования кардиомиоцитов и отдельных их компартментов. Цель данного исследования - изучить характер и распространенность экспрессии ММП-2 в кардиомиоцитах у крыс в динамике развития антрациклиновой кардиомиопатии. Материал и методы. Антрациклиновую кардиомиопатию моделировали у крыс-самцов линии Вистар (n=28), которым однократно внутрибрюшинно вводили доксорубицина гидрохлорид (ДОК) (Фармахеми Б. В., Нидерланды) в дозе 7 мг/кг в растворе 0,9% NaCl. Контрольным животным (n=5) одновременно с подопытными внутрибрюшинно однократно вводили изотонический раствор хлорида натрия в объеме, соответствующем массе их тела. Всех животных содержали в стандартных условиях вивария на полноценном рационе, вода ad libitum. Эксперименты проведены с соблюдением всех правил и рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Животных выводили из эксперимента декапитацией в первой половине дня через 3 и 14 сут после введения ДОК. После вскрытия животного и взвешивания сердца образцы миокарда фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином - эозином с постановкой реакции Перлса, по методу ван Гизона с докраской эластических волокон резорцин-фуксином по Вейгерту, ставили ШИК-реакцию. Экспрессию ММП-2 в миокарде оценивали с помощью метода иммуногистохимии. Использовали первичные поликлональные кроличьи антитела к ММП-2 в разведении 1:100 (Е18012, SpringBioscience, США). В качестве хромогена применяли 3,3’-диаминобензидин, срезы докрашивали гематоксилином и исследовали с помощью универсального микроскопа Leica DM 4000B (Leica, Германия). Используя планиметрический подход и компьютерную программу «Leica QWinV3», оценивали объемную плотность кардиомиоцитов с литическими повреждениями (при ув. 400, тестовая площадь была 61 171,56 мкм2). Проводили измерения площадей сечения кардиомиоцитов и относили к тестовой площади; для каждого животного анализировали не менее 30 неперекрывающихся полей зрения. С помощью компьютерной программы «Leica QWinV3» проводили подсчет ММР-2-позитивных ядер кардиомиоцитов при ув. 1000 (тестовая площадь - 9395,54 мкм2). Для каждого животного подсчет ядер кардиомиоцитов проводили на 20 непересекающихся тестовых площадях. Затем вычисляли индекс ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов. Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента, различия считали значимыми при P<0,05. Взаимосвязь разных морфометрических параметров оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Результаты исследования. Миокард контрольных животных был представлен в основном плотно расположенными мышечными волокнами, между которыми находились тонкие прослойки соединительной ткани и кровеносные сосуды. В миокарде у контрольных крыс встречались единичные кардиомиоциты с эозинофильной саркоплазмой (контрактурные повреждения преимущественно I и II степени) и кардиомиоциты с разреженной (лизированной) саркоплазмой (объемная плотность таких кардиомиоцитов составляла 3,5±0,7%). В миокарде контрольных животных ММП-2 выявлялась преимущественно в ядрах кардиомиоцитов. При этом интенсивность окрашивания была умеренной, индекс ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов составлял 29±5%. Через 3 сут после введения доксорубицина в миокарде наблюдали кардиомиоциты с различной интенсивностью окрашивания саркоплазмы эозином. Регистрировались отдельные кардиомиоциты или их небольшие группы с контрактурными повреждениями миофибрилл (эозинофильные сегменты), преимущественно II и III степени. В то же время, во всем миокарде присутствовали кардиомиоциты с признаками лизиса саркоплазмы, объемная плотность таких клеток возрастала в 5,4 раза (до 18,8±2,2%, P<0,001). Кардиомиоциты с контрактурными и литическими изменениями располагались среди клеток с нормальным строением и неизмененными тинкториальными свойствами. Следует отметить полиморфизм ядер кардиомиоцитов (увеличение их размеров, изменения формы и тинкториальных характеристик) и частое их смещение в подсарколеммальную зону. Нарушения гемодинамики проявлялись венозным и капиллярным полнокровием, лимфостазом, умеренным отеком. В этот срок эксперимента в миокарде возрастало количество кардиомиоцитов с ММП-2позитивными ядрами, усиливалась интенсивность их окрашивания (рисунок, а). Индекс ММП-2позитивных ядер кардиомиоцитов возрастал в 2,1 раза (до 60,4±1,9%, P<0,001). Одновременно в саркоплазме кардиомиоцитов начинала выявляться ММП-2-позитивная зернистость (см. рисунок, а). При этом следует особо отметить, что в саркоплазме кардиомиоцитов с контрактурными повреждениями миофибрилл ММП-2 не выявлялась ни в ядрах, ни в саркоплазме (см. рисунок, б). В кардиомиоцитах с субсегментарными контрактурами ММП-2 локализовалась в участках саркоплазмы, расположенных между полосами сокращения. Через 14 сут после однократного введения сублетальной дозы доксорубицина в миокарде усиливались деструктивные изменения, в 6,2 раза возрастала объемная плотность расположения кардиомиоцитов с литическими повреждениями (до 21,6±1,3%, P<0,001). Повсеместно встречались очаги некробиоза кардиомиоцитов, инфильтрированные мононуклеарными клетками, отмечалось их укрупнение. Сохранялись гемодинамические расстройства, происходило развитие диффузного кардиосклероза. В этот срок эксперимента локализация ММП-2 в кардиомиоцитах существенно не изменялась, но возрастала интенсивность окрашивания саркоплазмы кардиомиоцитов (см. рисунок, в). В кардиомиоцитах с контрактурными повреждениями ММП-2 не выявлялась (см. рисунок, г). В этот срок эксперимента еще в большей степени (в 2,6 раза по сравнению с контролем) возрастал индекс ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов (до 74,7±0,4%, P<0,001). Значительное увеличение ММП-2-позитивных ядер коррелировало с возрастанием объемной плотности кардиомиоцитов с литическими повреждениями саркоплазмы (r=0,942, P<0,05). Обсуждение полученных данных. Активацию ММП традиционно связывают с ремоделированием внеклеточного матрикса в разных органах и тканевых системах в физиологических условиях и при развитии широкого спектра патологических процессов [16]. В отношении миокарда эти процессы наиболее детально изучены при ишемических состояниях (в том числе, инфаркте миокарда), гипертрофии левого желудочка (преимущественно в результате гипертензивных состояний разного генеза), вирусных миокардитах и некоторых видах кардиомиопатий [9, 18]. Ремоделирование внеклеточного матрикса является одной из составляющих ремоделирования миокарда, в который вовлечены также все его клеточные популяции, в наибольшей степени кардиомиоциты, и сосудистое русло. Важно отметить, что многокомпонентный внеклеточный матрикс имеет структурно-функциональное значение, заключающееся в организации и регуляции жизнедеятельности кардиомиоцитов, процессов их регенерации, гибели и элиминации. Поэтому большое количество исследований посвящены изучению активации и ингибированию ММП во внеклеточном матриксе при очаговых и диффузных патологических процессах с целью поиска молекулярных мишеней и разработки фармакологических подходов для снижения фибропластических процессов и стимуляции пролиферативных реакций кардиомиоцитов. Обнаружение внутриклеточных локализаций ММП-2 в клетках миокарда, в том числе и в кардиомиоцитах, и ее активация при развитии окислительного стресса в условиях ишемии-реперфузии миокарда и действии провоспалительных цитокинов [8, 11, 14] положили начало новому направлению в изучении физиологической роли этой протеазы - выяснению протеолитической активности в отношении структурных белков (ядерных и саркоплазматических) кардиомиоцитов как молекулярной основы развития сердечной дисфункции. С помощью различных методических подходов установлено, что ММП-2 локализуется в саркомерах вблизи регуляторного белка тропонина I [4], легкой цепи-1 миозина, белков цитоскелета α-актинина и десмина [19], ядерных белков (ферментов, участвующих в репарации ДНК и др.) [6], в протеолизе которых ММП-2 принимает участие. Осуществляя протеолитическое расщепление ряда саркоплазматических и ядерных белков, ММП-2 играет важную роль в ремоделировании внутриклеточных структур, их деструкции и инициации, таким образом, процессов внутриклеточной регенерации (репарации) или гибели кардиомиоцитов. Ингибирование ММП-2 с помощью доксициклина или о-фенантролина снижает или предотвращает протеолитическое расщепление упомянутых выше белков при окислительном стрессе кардиомиоцитов, вызванном разными причинами [14]. Усиление активности ММП-2 в плазме крови и миокарде после введения мелким грызунам больших доз доксорубицина (15-25 мг/кг) было установлено с помощью биохимических методов и зимографии [7, 12]. Усиление активности ММП-2 в этих случаях сопровождалось увеличением активности Akt-киназы, ингибированием супероксиддисмутазы, повышением продукции супероксида и оксида азота. Эти данные указывают на то, что активация ММП-2 в миокарде при антрациклиновых повреждениях обусловлена преимущественно развитием окислительного стресса и снижением антиоксидантной защиты. В нашем исследовании с помощью иммуногистохимического анализа ММП-2 была выявлена преимущественно в ядрах кардиомиоцитов как у контрольных, так и у подопытных крыс, подвергнутых однократному воздействию сублетальной дозы (7 мг/кг) доксорубицина. Развитие антрациклиновой кардиомиопатии, усиление литических повреждений кардиомиоцитов сопровождалось увеличением в 2,6 раза индекса MMП2-позитивных ядер кардиомиоцитов и появлением продуктов иммуногистохимической реакции в их саркоплазме. При этом мы не обнаружили ММП- 2-позитивного окрашивания стромы миокарда во все сроки эксперимента. Подобные результаты были получены при моделировании хронической даунорубицин-и доксорубицининдуцированной кардиомиопатии у кроликов - иммуногистохимически ММП-2 выявлялась в кардиомиоцитах и фибробластах, но не во внеклеточном матриксе [3, 5]. Присутствие ММП-2 в ядрах кардиомиоцитов у контрольных животных и увеличение ее экспрессии при действии антрациклиновых антибиотиков, индуцирующих усиленную генерацию активных форм кислорода [17], свидетельствуют о том, что ММП-2 относится к конститутивным формам ядерных белков, экспрессия которых значительно возрастает при цитопатических воздействиях. Возрастание экспрессии ММП-2 безусловно связано с усилением протеолитического расщепления ядерных белков (например, ламина А, поли-АДФ-рибозаполимеразы) [6, 15], что можно отнести к механизмам повреждающего действия. В то же время, присутствие ММП-2 в ядрах кардиомиоцитов в норме позволяет сделать вывод, что эта протеиназа играет важную роль в процессах клеточного роста, клеточном цикле, возможно полиплоидизации, при которых ремоделирование нуклеоплазмы имеет большое значение. Выявление сильной положительной корреляционной связи между объемной плотностью кардиомиоцитов с литическими изменениями саркоплазмы и индексом MMП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов свидетельствует о важной роли данной металлопротеиназы в доксорубицининдуцированных повреждениях кардиомиоцитов. Поскольку по мере развития антрациклиновой кардиомиопатии происходило не только увеличение индекса MMП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов, но и усиление интенсивности окрашивания саркоплазмы при постановке иммуногистохимической реакции и нарастание деструктивных процессов в кардиомиоцитах, можно рассматривать индекс MMП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов в качестве дополнительного критерия выраженности цитотоксического эффекта доксорубицина (и подобных ему химических соединений). Таким образом, ММП-2 в миокарде у контрольных крыс и крыс, подвергнутых воздействию сублетальной дозы доксорубицина, экспрессируется преимущественно в ядрах кардиомиоцитов. По мере развития антрациклиновой кардиомиопатии ММП-2 начинает выявляться в саркоплазме кардиомиоцитов. При этом в контрактурно измененных кардиомиоцитах ММП-2 не регистрируется. Выявлена положительная корреляционная связь между объемной плотностью кардиомиоцитов с литическими повреждениями саркоплазмы и индексом ММП-2-позитивных ядер кардиомиоцитов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ММП-2 может вносить вклад в развитие литических изменений кардиомиоцитов и обусловливать их последующую деструкцию.

About the authors

Ye. L. Lushnikova

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology (Novosibirsk)

Email: pathol@inbox.ru

D. B. Nikityuk

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology (Novosibirsk)

M. G. Klinnikova

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology (Novosibirsk)

Ye. V. Koldysheva

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology (Novosibirsk)

M. M. Mzhel’skaya

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology (Novosibirsk)

References

Supplementary files