ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗА В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫСЫ

Полный текст

Глутаминсинтетаза (ГС) является ключевым ферментом метаболизма важнейшего возбуждающего нейромедиатора - глутамата. Результаты ранних иммуногистохимических исследований [11] показали, что ГС выявляется исключительно в астроцитах и отсутствует в других клетках мозга. Позже ее обнаружили и в олигодендроцитах [6, 7], однако данные, полученные в результате этих исследований, как полагают, могут быть следствием использования плохо очищенных антител, а сделанные выводы - результатом расхождений в интерпретациях полученных данных. В настоящее время лучше изучено внутриклеточное распределение ГС в астроцитах [3, 12], тогда как данные об обнаружении этого белка в других клетках нервной ткани млекопитающих фрагментарны и противоречивы [5, 8]. Сведения о локализации такого важного фермента, как ГС, участвующего в регуляции синаптических процессов и межклеточных взаимодействий, необходимы для разработки новых подходов к определению функциональной активности клеток головного мозга in situ, а также для совершенствования критериев оценки состояния глутаматергической системы головного мозга при гистологическом исследовании. Целью настоящей работы было иммуногистохимическое исследование клеток головного мозга крысы, синтезирующих ГС. Материал и методы. В работе использован целый головной мозг половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n=10). Умерщвление животных проводили с соблюдением международных правил Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. На данное исследование получено разрешение этического комитета (№ 1/14 от 21.04.2014 г.). Головной мозг крыс фиксировали в цинк-этанолформальдегиде, который обеспечивает высокую сохранность антигенов, необходимую для получения оптимальных результатов при постановке иммуноцитохимических реакций [1, 10]. Фиксированный мозг разрезали во фронтальной плоскости на уровне переднего гиппокампа, обезвоживали и обе части мозга заливали в парафин по общепринятой методике. Из полученных блоков готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Leica, Германия). Для иммуноцитохимического выявления ГС были использованы мышиные моноклональные антитела (клон GS-6, разведение 1:400, Chemicon, США). Для световой микроскопии в качестве вторичных реагентов использовали набор EnVision+ System Labelled Polymer-HRP Anti-Mouse (Dako, Дания). Перед постановкой реакции проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере (S1700, Dako, Дания) в течение 25 мин. После постановки иммуногистохимических реакций часть срезов докрашивали квасцовым гематоксилином. Для конфокальной лазерной микроскопии в качестве вторичных антител были использованы биотинилированный антимышиный Fabфрагмент иммуноглобулинов осла (Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:200) и стрептавидин, конъюгированный с флюоресцентным красителем карбоцианином (Cy2; Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:50). Для подтверждения астроглиальной природы части выявляемых клеток были проведены двойные иммунофлюоресцентные реакции с использованием наиболее селективного маркера астроцитов [2] - глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ). При этом в качестве первичных антител применяли поликлональные кроличьи антитела к ГФКБ (Dako, Дания), а в качестве вторичных - свиные антикроличьи антитела, конъюгированные с тетраметилродамин-изотиоцианатом (TRITC) в разведении 1:25. Ядра клеток окрашивали флюоресцентным красителем ToPro3. Анализ препаратов при микроскопии в проходящем свете и фотосъемку при малом (об. 10) и большом (об. 100) увеличениях выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и цифровую фотокамеру ICC50 (Leica, Германия). Препараты, обработанные антителами, конъюгированными с флюорохромами, исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM-710 (Zeiss, Германия), их трехмерную реконструкцию проводили с использованием компьютерной программы ZEN-2011 (Zeiss, Германия). Для возбуждения флюоресценции Су2, TRITC и ToPro3 использовали лазеры с длиной волны 488, 561 и 633 нм соответственно. Измерения проводили с помощью компьютерной программы LSM Image Browser (Zeiss, Германия). Результаты исследования. Изучение препаратов при малом увеличении позволяет обнаружить неодинаковое распределение иммунореактивных клеток в различных отделах головного мозга. Так, наибольшая интенсивность окраски отмечается в области поверхностной глиальной пограничной мембраны, в глубоких слоях коры большого мозга, в том числе в области пириформной коры, и в белом веществе мозга. Из нервных центров наибольшая реакция на ГС характерна для латерального ядра перегородки, поводка, стриатума и гиппокампа. Менее выражена реакция в наружных слоях неокортекса, ядрах таламуса и гипоталамуса, в клетках, образующих стенки желудочков мозга, субвентрикулярной зоне и сосудистом сплетении. Однако присутствие слабой иммунопозитивной реакции цитоплазмы в клетках сосудистого сплетения не находит убедительного подтверждения при исследовании препаратов с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Исследование препаратов при большом увеличении позволяет выявить у поверхности мозга монослой иммунопозитивных клеток клиновидной формы (рис. 1). Широкое основание клеток обращено в сторону поверхности, а от верхушки вглубь нервной ткани отходят небольшое число относительно длинных (некоторые - до 60 мкм) волнистых (максимальная амплитуда волны до 3 мкм) неветвящихся отростков толщиной 0,7-0,9 мкм. Детальное изучение остальных областей, имеющих повышенную иммунореактивность, позволяет обнаружить 2 различных типа интенсивно окрашенных клеток. В зонах, соответствующих серому веществу коры и нервных центров, преобладающий тип представлен звездчатыми клетками с центрально расположенным иммунонегативным ядром и ярким ободком перинуклеарной цитоплазмы, от которой в радиальном направлении отходят 3-4 крупных отростка толщиной 3-4 мкм, дающих более мелкие отростки. Эти клетки располагаются между нейронами, нередко окружая их своими телами или отростками, а также вокруг кровеносных сосудов (рис. 2, а). В белом веществе мозга обнаружено небольшое число иммунореактивных клеток этого типа. Двойная иммунофлюоресцентная реакция (ГФКБ/ ГС) показала, что часть этих клеток иммунонегативны по отношению к ГС. Другой тип представлен безотростчатыми (или одноотростчатыми) округлыми клетками с ярко окрашенной цитоплазмой и иммунонегативным ядром. В зонах, соответствующих серому веществу коры и нервных центров, эти клетки располагаются диффузно поодиночке (см. рис. 2, б) либо группируются по две. В белом веществе их число увеличивается, здесь они уже располагаются группами по 3-5 клеток в виде цепочек, вытянутых вдоль иммунонегативных нервных волокон. Обсуждение полученных данных. Полученные данные указывают на распространенность ГС в клетках ЦНС крысы. При этом отмечается неравномерность ее расположения в различных образованиях мозга. Четко контурируемые ГС-позитивные отростчатые клетки разных областей мозга, участвующие в формировании поверхностной и периваскулярной глиальных пограничных мембран, с учетом их структуры и расположения следует идентифицировать в качестве астроцитов. Принадлежность этих клеток к популяции астроцитов подтверждает и их иммунопозитивная реакция на ГФКБ. Второй тип ГС-позитивных безотростчатых (или одноотростчатых) клеток по морфологическим характеристикам и локализации не может быть отождествлен с типичными астроцитами. Исходя из размеров и формы ядра, ГС-иммунопозитивные клетки второго типа не могут быть клетками микроглии и нейронами, но могут представлять собой атипичные популяции астроцитов либо олигодендроцитов. Однако, если обилие ГС-позитивных астроцитов в зонах расположения крупных нейронов объясняется их ключевой ролью в глутамат/глутаминовом цикле [4, 9], то значение их наличия в белом веществе остается пока непонятным. Возможно, ГС-позитивные астроциты и олигодендроциты белого вещества способны участвовать в элиминации избытка глутамата черного вещества, ядер гипоталамуса. Однако для предотвращения локального эксайтотоксиче-это может объясняться использованием иных, ского повреждения нервных волокон. Ни в одной менее специфичных антител при выявлении ГС, из исследованных областей ГС не была обнару-а также выполнением исследования на другом жена в перикарионах нейронов, что не совпада-объекте - мозге человека. Неменьший интерес ет с данными других исследователей [5], отме-вызывает выявление ГС-негативных астроцитов. чавших присутствие ГС в нейронах гиппокампа, Если придерживаться факта экспрессии ГС этими клетками, данное наблюдение может указывать на то, что ГС-негативные астроциты находятся в измененном функциональном состоянии, при котором происходит подавление синтеза изучаемого фермента. Кроме того, негативный результат иммуноцитохимической реакции части астроцитов может объясняться тем, что ГС в них либо не экспрессируется совсем, либо образуется в таком малом количестве, что использованные нами методы не позволяют ее обнаружить. Таким образом, полученные в ходе настоящего исследования данные свидетельствуют о том, что ГС экспрессируется двумя клеточными популяциями: типичными астроцитами и другой клеточной популяцией, в состав которой могут входить атипичные астроциты и, с небольшой вероятностью, олигодендроциты. В связи с этим, по нашему мнению, данный белок не может рассматриваться в качестве селективного маркера только одного типа клеток.

Об авторах

Елена Геннадьевна Сухорукова

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Валерия Владимировна Гусельникова

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: dek2@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы