GLUTAMINE SYNTHETASE IN RAT BRAIN CELLS

全文:

Глутаминсинтетаза (ГС) является ключевым ферментом метаболизма важнейшего возбуждающего нейромедиатора - глутамата. Результаты ранних иммуногистохимических исследований [11] показали, что ГС выявляется исключительно в астроцитах и отсутствует в других клетках мозга. Позже ее обнаружили и в олигодендроцитах [6, 7], однако данные, полученные в результате этих исследований, как полагают, могут быть следствием использования плохо очищенных антител, а сделанные выводы - результатом расхождений в интерпретациях полученных данных. В настоящее время лучше изучено внутриклеточное распределение ГС в астроцитах [3, 12], тогда как данные об обнаружении этого белка в других клетках нервной ткани млекопитающих фрагментарны и противоречивы [5, 8]. Сведения о локализации такого важного фермента, как ГС, участвующего в регуляции синаптических процессов и межклеточных взаимодействий, необходимы для разработки новых подходов к определению функциональной активности клеток головного мозга in situ, а также для совершенствования критериев оценки состояния глутаматергической системы головного мозга при гистологическом исследовании. Целью настоящей работы было иммуногистохимическое исследование клеток головного мозга крысы, синтезирующих ГС. Материал и методы. В работе использован целый головной мозг половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n=10). Умерщвление животных проводили с соблюдением международных правил Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. На данное исследование получено разрешение этического комитета (№ 1/14 от 21.04.2014 г.). Головной мозг крыс фиксировали в цинк-этанолформальдегиде, который обеспечивает высокую сохранность антигенов, необходимую для получения оптимальных результатов при постановке иммуноцитохимических реакций [1, 10]. Фиксированный мозг разрезали во фронтальной плоскости на уровне переднего гиппокампа, обезвоживали и обе части мозга заливали в парафин по общепринятой методике. Из полученных блоков готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Leica, Германия). Для иммуноцитохимического выявления ГС были использованы мышиные моноклональные антитела (клон GS-6, разведение 1:400, Chemicon, США). Для световой микроскопии в качестве вторичных реагентов использовали набор EnVision+ System Labelled Polymer-HRP Anti-Mouse (Dako, Дания). Перед постановкой реакции проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере (S1700, Dako, Дания) в течение 25 мин. После постановки иммуногистохимических реакций часть срезов докрашивали квасцовым гематоксилином. Для конфокальной лазерной микроскопии в качестве вторичных антител были использованы биотинилированный антимышиный Fabфрагмент иммуноглобулинов осла (Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:200) и стрептавидин, конъюгированный с флюоресцентным красителем карбоцианином (Cy2; Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:50). Для подтверждения астроглиальной природы части выявляемых клеток были проведены двойные иммунофлюоресцентные реакции с использованием наиболее селективного маркера астроцитов [2] - глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ). При этом в качестве первичных антител применяли поликлональные кроличьи антитела к ГФКБ (Dako, Дания), а в качестве вторичных - свиные антикроличьи антитела, конъюгированные с тетраметилродамин-изотиоцианатом (TRITC) в разведении 1:25. Ядра клеток окрашивали флюоресцентным красителем ToPro3. Анализ препаратов при микроскопии в проходящем свете и фотосъемку при малом (об. 10) и большом (об. 100) увеличениях выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и цифровую фотокамеру ICC50 (Leica, Германия). Препараты, обработанные антителами, конъюгированными с флюорохромами, исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM-710 (Zeiss, Германия), их трехмерную реконструкцию проводили с использованием компьютерной программы ZEN-2011 (Zeiss, Германия). Для возбуждения флюоресценции Су2, TRITC и ToPro3 использовали лазеры с длиной волны 488, 561 и 633 нм соответственно. Измерения проводили с помощью компьютерной программы LSM Image Browser (Zeiss, Германия). Результаты исследования. Изучение препаратов при малом увеличении позволяет обнаружить неодинаковое распределение иммунореактивных клеток в различных отделах головного мозга. Так, наибольшая интенсивность окраски отмечается в области поверхностной глиальной пограничной мембраны, в глубоких слоях коры большого мозга, в том числе в области пириформной коры, и в белом веществе мозга. Из нервных центров наибольшая реакция на ГС характерна для латерального ядра перегородки, поводка, стриатума и гиппокампа. Менее выражена реакция в наружных слоях неокортекса, ядрах таламуса и гипоталамуса, в клетках, образующих стенки желудочков мозга, субвентрикулярной зоне и сосудистом сплетении. Однако присутствие слабой иммунопозитивной реакции цитоплазмы в клетках сосудистого сплетения не находит убедительного подтверждения при исследовании препаратов с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Исследование препаратов при большом увеличении позволяет выявить у поверхности мозга монослой иммунопозитивных клеток клиновидной формы (рис. 1). Широкое основание клеток обращено в сторону поверхности, а от верхушки вглубь нервной ткани отходят небольшое число относительно длинных (некоторые - до 60 мкм) волнистых (максимальная амплитуда волны до 3 мкм) неветвящихся отростков толщиной 0,7-0,9 мкм. Детальное изучение остальных областей, имеющих повышенную иммунореактивность, позволяет обнаружить 2 различных типа интенсивно окрашенных клеток. В зонах, соответствующих серому веществу коры и нервных центров, преобладающий тип представлен звездчатыми клетками с центрально расположенным иммунонегативным ядром и ярким ободком перинуклеарной цитоплазмы, от которой в радиальном направлении отходят 3-4 крупных отростка толщиной 3-4 мкм, дающих более мелкие отростки. Эти клетки располагаются между нейронами, нередко окружая их своими телами или отростками, а также вокруг кровеносных сосудов (рис. 2, а). В белом веществе мозга обнаружено небольшое число иммунореактивных клеток этого типа. Двойная иммунофлюоресцентная реакция (ГФКБ/ ГС) показала, что часть этих клеток иммунонегативны по отношению к ГС. Другой тип представлен безотростчатыми (или одноотростчатыми) округлыми клетками с ярко окрашенной цитоплазмой и иммунонегативным ядром. В зонах, соответствующих серому веществу коры и нервных центров, эти клетки располагаются диффузно поодиночке (см. рис. 2, б) либо группируются по две. В белом веществе их число увеличивается, здесь они уже располагаются группами по 3-5 клеток в виде цепочек, вытянутых вдоль иммунонегативных нервных волокон. Обсуждение полученных данных. Полученные данные указывают на распространенность ГС в клетках ЦНС крысы. При этом отмечается неравномерность ее расположения в различных образованиях мозга. Четко контурируемые ГС-позитивные отростчатые клетки разных областей мозга, участвующие в формировании поверхностной и периваскулярной глиальных пограничных мембран, с учетом их структуры и расположения следует идентифицировать в качестве астроцитов. Принадлежность этих клеток к популяции астроцитов подтверждает и их иммунопозитивная реакция на ГФКБ. Второй тип ГС-позитивных безотростчатых (или одноотростчатых) клеток по морфологическим характеристикам и локализации не может быть отождествлен с типичными астроцитами. Исходя из размеров и формы ядра, ГС-иммунопозитивные клетки второго типа не могут быть клетками микроглии и нейронами, но могут представлять собой атипичные популяции астроцитов либо олигодендроцитов. Однако, если обилие ГС-позитивных астроцитов в зонах расположения крупных нейронов объясняется их ключевой ролью в глутамат/глутаминовом цикле [4, 9], то значение их наличия в белом веществе остается пока непонятным. Возможно, ГС-позитивные астроциты и олигодендроциты белого вещества способны участвовать в элиминации избытка глутамата черного вещества, ядер гипоталамуса. Однако для предотвращения локального эксайтотоксиче-это может объясняться использованием иных, ского повреждения нервных волокон. Ни в одной менее специфичных антител при выявлении ГС, из исследованных областей ГС не была обнару-а также выполнением исследования на другом жена в перикарионах нейронов, что не совпада-объекте - мозге человека. Неменьший интерес ет с данными других исследователей [5], отме-вызывает выявление ГС-негативных астроцитов. чавших присутствие ГС в нейронах гиппокампа, Если придерживаться факта экспрессии ГС этими клетками, данное наблюдение может указывать на то, что ГС-негативные астроциты находятся в измененном функциональном состоянии, при котором происходит подавление синтеза изучаемого фермента. Кроме того, негативный результат иммуноцитохимической реакции части астроцитов может объясняться тем, что ГС в них либо не экспрессируется совсем, либо образуется в таком малом количестве, что использованные нами методы не позволяют ее обнаружить. Таким образом, полученные в ходе настоящего исследования данные свидетельствуют о том, что ГС экспрессируется двумя клеточными популяциями: типичными астроцитами и другой клеточной популяцией, в состав которой могут входить атипичные астроциты и, с небольшой вероятностью, олигодендроциты. В связи с этим, по нашему мнению, данный белок не может рассматриваться в качестве селективного маркера только одного типа клеток.

作者简介

Ye. Sukhorukova

RAS Institute of experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System Department of General and Special Morphology 12 Akademika Pavlova St, 197376, St. Petersburg

V. Gusel’nikova

RAS Institute of experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System Department of General and Special Morphology 12 Akademika Pavlova St, 197376, St. Petersburg

D. Korzhevskiy

RAS Institute of experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System Department of General and Special Morphology 12 Akademika Pavlova St, 197376, St. Petersburg

参考

补充文件