МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГЕПАТОЦИТОВ ТРЕХ ЗОН ДОЛЬКИ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ В ВОССТАНОВИТЕЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ПЕРЕЛОМА КОСТЕЙ ГОЛЕНИ НА ФОНЕ ПОТРЕБЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА АМИНОКИСЛОТ

Полный текст

Известно, что в восстановительном периоде после повреждения костной ткани в печени развиваются структурные [5, 8] и функциональные [12] нарушения, обусловленные развитием циркуляторно-гипоксических повреждений клеточных структур и усилением эндотоксикоза [13]. В свою очередь, полифункциональность печени и ее интеграционная роль в обмене веществ обеспечивают восстановление энергетического и пластического баланса организма после травмы и влияют на восстановление структуры костной ткани [12]. Имеются ряд работ, посвященных коррекции морфофункциональных нарушений печени и активации метаболических процессов [7, 15]. Исследования последних лет свидетельствуют о протекторном эффекте аминокислот, регулирующих разнонаправленные клеточные процессы. Лейцин активирует апоптотоз, аргинин - пролиферацию, а изолейцин угнетает пролиферацию [14]. Показано эффективное влияние метионина на внутриклеточный метаболизм гепатоцитов, синтез фосфолипидов и нуклеиновых кислот и метилирование токсических соединений [7]. Однако вопросы об источниках и механизмах репаративной регенерации печени при действии как повреждающих факторов, так и гепатопротекторов, являются в настоящее время достаточно дискуссионными [3, 5]. Цель работы - выявить динамику морфометрических показателей гепатоцитов после перелома костей голени и обосновать влияние аминокислотной смеси (в равном весовом соотношении: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) на восстановительные процессы в печени. Материал и методы. В эксперименте использованы 66 самцов мышей линии CBA 2-3 мес постнатального развития. Животные были разделены на 4 группы: контрольная (12 интактных мышей), 1-, 2-яи 3-я экспериментальные (54 особи). У животных экспериментальных групп моделировали перелом костей голени (ПГ) путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности под диэтиловым наркозом. Мыши контрольной и 1-й группы (18 особей) в восстановительном периоде после ПГ находились на стандартном рационе питания, сбалансированном по белку (3,3 г/сут перевариваемого протеина) и углеводам. Мыши 2-й группы (18 особей) в восстановительном периоде после ПГ находились на изокалорийном, обедненном белком рационе (0,88 г/сут), в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию лизина, метионина, треонина (ИКОБР). 2-я группа экстраполирована нами как пациенты с возможным нарушением минерального обмена и процессов ремоделирования костной ткани при гипотрофии [6]. Мыши 3-й группы (18 особей) после перелома костей голени находились на ИКОБР, но при этом недостаток белка в пище восполняли смесью аминокислот (в равном весовом соотношении: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) в виде взвеси к пшеничному глиадину (патент РФ № 2454227) [9]. Мыши получали в свободном доступе дистиллированную воду и суточный рацион питания. Животных выводили из эксперимента на 3-, 7-еи 28-е сутки после травмы по 6 животных в каждой группе в соответствии с посттравматическими стадиями регенерации костной ткани: первичной реакции на повреждение (3-и сутки) и адаптивной перестройки через 7 и 28 сут [4]. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. На проведение исследования получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ „ВТО” им. акад. Г. А. Илизарова» Минздрава России [№ 6 (31) от 06.12.2012 г.]. Для гистологического исследования брали образцы левой боковой доли печени. Кусочки фиксировали в 10 % нейтральном формалине, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином - эозином. С помощью АПК «ДиаМорфcito» (Россия, рег. удостоверение МЗ РФ № 98/219-137) оцифровывали поля зрения зон печеночной дольки (об. 40) центральной, примыкающей к центральной вене, периферической, примыкающей к портальному тракту, промежуточной зоне - равноудаленной от центральной вены и портального тракта [9]. Используя программу для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4.0» (Россия), измеряли диаметр одноядерных форм гепатоцитов и их ядер, определяли площадь сечения ядра и цитоплазмы (мкм2), вычисляли ядерно-цитоплазматический индекс гепатоцитов (ЯЦИ), объем клетки и ядра (мкм3) [1]. Для анализа степени реализации восстановительных резервов печени в двенадцати полях зрения трех зон печеночной дольки (центральной, промежуточной, периферической) подсчитывали число одноядерных и двуядерных форм гепатоцитов, определяли относительное содержание двуядерных клеток (%). Также определяли митотический индекс гепатоцитов дольки печени (‰). Для определения значимости различий использовали непараметрический критерий Вилкоксона для независимых выборок. Критический уровень значимости различий результатов (р) принимали равным 0,05. Результаты исследования. У мышей 2-й группы на всех этапах восстановительного периода выявлено уменьшение объема клеток и ядер гепатоцитов в трех зонах печеночных долек (р<0,001) относительно животных интактных и 1-й группы при значимо высоком ЯЦИ на всех этапах наблюдения (рис. 1, табл. 1). В 3-й группе выявлено значимое увеличение объема гепатоцитов в периферических и центральных зонах через 3 и 7 сут эксперимента, а через 28 сут, напротив, снижение в периферических зонах относительно животных интактных, 1-йи 2-й группы. Увеличение объема ядер гепатоцитов отмечалось на 3-и сутки после травмы в центральных и периферических, 7-еи 28-е сутки в центральных зонах (р<0,001) относительно интактной и 2-й группы (см. рис. 1). Снижение выявлено в периферических зонах на 28-е сутки (р<0,001) относительно интактной и 1-й группы. Повышение ЯЦИ отмечалось через 3 сут в периферических и промежуточных зонах (р<0,001) относительно интактной и 1-й группы, а через 7 и 28 сут, напротив, снижение в трех зонах печеночных долек (р<0,001) при сравнении с животными 1-йи 2-й группы (см. рис. 1, табл. 1). У мышей 2-й группы обнаружено значимое повышение содержания двуядерных форм гепатоцитов в центральных зонах печеночных долек на 28-е сутки восстановительного периода относительно нормы, но снижение относительно 1-й группы. Повышение митотической активности гепатоцитов выявлено через 3 сут (р<0,05) относительно животных интактной, 1-йи 3-й группы, а через 7 сут - значимое снижение (рис. 2, табл. 2). В 3-й группе обнаружено значимое снижение содержания двуядерных форм гепатоцитов через 3 сут после травмы в промежуточных, через 7 сут - центральных, промежуточных и периферических, через 28 сут - периферических и промежуточных зонах, но в центральных зонах, напротив, отмечалось их повышение (р<0,05) относительно нормы. Снижение митотической активности выявлено на 3-и сутки, повышение отмечалось на 7-еи 28-е сутки (р<0,05) относительно животных интактной, 1-йи 2-й группы (см. рис. 2, табл. 2). Обсуждение полученных данных. Существенные изменения морфометрических показателей гепатоцитов выявлены у мышей, находившихся на изокалорийном, обедненном белком рационе. Отмечалось увеличение митотического индекса гепатоцитов на первом этапе эксперимента и ЯЦИ при снижении объема клеток и их ядер в центральных, промежуточных и периферических зонах долек печени на всех этапах наблюдения (3-, 7-еи 28-е сутки). Возможно, структурные белки гепатоцитов, как лабильный резерв аминокислот [11], расходовались в процессе адаптивных перестроек организма для поддержания гомеостаза. Снижение интенсивности процессов синтеза внутриклеточных структур [11] является дополнительным стимулирующим фактором пролиферации гепатоцитов наряду с их гибелью [3], обусловленной внутриорганными гемодинамическими сдвигами (венозный стаз, отек стромы и гепатоцитов) после нарушения целостности кости [13]. Повышение митотического индекса и содержания двуядерных форм гепатоцитов может быть реализацией восстановительных резервов печени при функциональной недостаточности клеток паренхимы [2]. По нашему мнению, функциональная нагрузка на печень значительно повышается при действии двух факторов - повреждения костной ткани и обедненного белком изокалорийного рациона. При анализе эффективности применения аминокислотной смеси на течение репаративного процесса выявлены признаки внутриклеточной регенерации. Повышение ЯЦИ клеток в периферических и промежуточных зонах через 3 сут и размера их ядер в центральных зонах через 7 сут эксперимента свидетельствует о росте функциональной активности гепатоцитов, которая зависит от степени биологической и функциональной зрелости клеток и их топографического положения в печеночной дольке [10]. Отмеченная гипертрофия гепатоцитов в периферических и центральных зонах печеночной дольки может быть направлена как на усиление функции печени, так и подготовку клеток к делению [2]. С 7-х суток наблюдения митотическая активность гепатоцитов возрастала. Содержание двуядерных форм гепатоцитов повышалось в центральных зонах, но снижалось в периферических и промежуточных зонах, ЯЦИ соответствовал возрастной норме к концу наблюдения. Выявленные изменения являются следствием мобилизации компенсаторно-приспособительных процессов в органе для поддержания гомеостаза и функционального напряжения печени [2, 3]. Вероятно, применение незаменимых (лейцин, изолейцин и метионин) и полузаменимых (аргинин) аминокислот влияло на восстановительные процессы в печени, регулируя направленность метаболизма. При введении в рацион мышей аминокислотной смеси с 7-х суток эксперимента клеточный механизм регенерации сочетался с внутриклеточной регенерацией гепатоцитов. Источником репаративной регенерации печени у животных являются как периферическая, так и центральная зоны печеночной дольки. Таким образом, полученные данные дают основание полагать, что применение аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин и метионин в равных весовых соотношениях) оказывает стимулирующее влияние на развитие восстановительных процессов в печени. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: М. В. С. Сбор и обработка материала: Р. Ю. О. Статистическая обработка данных: Р. Ю. О. Анализ и интерпретация данных: Р. Ю. О., О. З. М. Написание текста: Р. Ю. О. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Руфина Юрьевна Очеретина

Российский научный центр „Восстановительная травматология и ортопедия” им. акад. Г. А. Илизарова

Email: rufoch@mail.ru
лаборатория биохимии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Офелия Завеновна Мкртчан

Омский государственный педагогический университет

кафедра биологии и биологического образования 644099, г. Омск, наб. им. Тухачевского, 14

Максим Валерьевич Стогов

Российский научный центр „Восстановительная травматология и ортопедия” им. акад. Г. А. Илизарова

лаборатория биохимии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы