MORPHOMETRIC PARAMETERS OF HEPATOCYTES IN THREE ZONES OF MOUSE HEPATIC LOBULES IN THE RECOVERY PERIOD AFTER SHIN BONES FRACTURE AND AMINO ACID COMPLEX TREATMENT

Full Text

Известно, что в восстановительном периоде после повреждения костной ткани в печени развиваются структурные [5, 8] и функциональные [12] нарушения, обусловленные развитием циркуляторно-гипоксических повреждений клеточных структур и усилением эндотоксикоза [13]. В свою очередь, полифункциональность печени и ее интеграционная роль в обмене веществ обеспечивают восстановление энергетического и пластического баланса организма после травмы и влияют на восстановление структуры костной ткани [12]. Имеются ряд работ, посвященных коррекции морфофункциональных нарушений печени и активации метаболических процессов [7, 15]. Исследования последних лет свидетельствуют о протекторном эффекте аминокислот, регулирующих разнонаправленные клеточные процессы. Лейцин активирует апоптотоз, аргинин - пролиферацию, а изолейцин угнетает пролиферацию [14]. Показано эффективное влияние метионина на внутриклеточный метаболизм гепатоцитов, синтез фосфолипидов и нуклеиновых кислот и метилирование токсических соединений [7]. Однако вопросы об источниках и механизмах репаративной регенерации печени при действии как повреждающих факторов, так и гепатопротекторов, являются в настоящее время достаточно дискуссионными [3, 5]. Цель работы - выявить динамику морфометрических показателей гепатоцитов после перелома костей голени и обосновать влияние аминокислотной смеси (в равном весовом соотношении: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) на восстановительные процессы в печени. Материал и методы. В эксперименте использованы 66 самцов мышей линии CBA 2-3 мес постнатального развития. Животные были разделены на 4 группы: контрольная (12 интактных мышей), 1-, 2-яи 3-я экспериментальные (54 особи). У животных экспериментальных групп моделировали перелом костей голени (ПГ) путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности под диэтиловым наркозом. Мыши контрольной и 1-й группы (18 особей) в восстановительном периоде после ПГ находились на стандартном рационе питания, сбалансированном по белку (3,3 г/сут перевариваемого протеина) и углеводам. Мыши 2-й группы (18 особей) в восстановительном периоде после ПГ находились на изокалорийном, обедненном белком рационе (0,88 г/сут), в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию лизина, метионина, треонина (ИКОБР). 2-я группа экстраполирована нами как пациенты с возможным нарушением минерального обмена и процессов ремоделирования костной ткани при гипотрофии [6]. Мыши 3-й группы (18 особей) после перелома костей голени находились на ИКОБР, но при этом недостаток белка в пище восполняли смесью аминокислот (в равном весовом соотношении: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) в виде взвеси к пшеничному глиадину (патент РФ № 2454227) [9]. Мыши получали в свободном доступе дистиллированную воду и суточный рацион питания. Животных выводили из эксперимента на 3-, 7-еи 28-е сутки после травмы по 6 животных в каждой группе в соответствии с посттравматическими стадиями регенерации костной ткани: первичной реакции на повреждение (3-и сутки) и адаптивной перестройки через 7 и 28 сут [4]. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. На проведение исследования получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ „ВТО” им. акад. Г. А. Илизарова» Минздрава России [№ 6 (31) от 06.12.2012 г.]. Для гистологического исследования брали образцы левой боковой доли печени. Кусочки фиксировали в 10 % нейтральном формалине, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином - эозином. С помощью АПК «ДиаМорфcito» (Россия, рег. удостоверение МЗ РФ № 98/219-137) оцифровывали поля зрения зон печеночной дольки (об. 40) центральной, примыкающей к центральной вене, периферической, примыкающей к портальному тракту, промежуточной зоне - равноудаленной от центральной вены и портального тракта [9]. Используя программу для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4.0» (Россия), измеряли диаметр одноядерных форм гепатоцитов и их ядер, определяли площадь сечения ядра и цитоплазмы (мкм2), вычисляли ядерно-цитоплазматический индекс гепатоцитов (ЯЦИ), объем клетки и ядра (мкм3) [1]. Для анализа степени реализации восстановительных резервов печени в двенадцати полях зрения трех зон печеночной дольки (центральной, промежуточной, периферической) подсчитывали число одноядерных и двуядерных форм гепатоцитов, определяли относительное содержание двуядерных клеток (%). Также определяли митотический индекс гепатоцитов дольки печени (‰). Для определения значимости различий использовали непараметрический критерий Вилкоксона для независимых выборок. Критический уровень значимости различий результатов (р) принимали равным 0,05. Результаты исследования. У мышей 2-й группы на всех этапах восстановительного периода выявлено уменьшение объема клеток и ядер гепатоцитов в трех зонах печеночных долек (р<0,001) относительно животных интактных и 1-й группы при значимо высоком ЯЦИ на всех этапах наблюдения (рис. 1, табл. 1). В 3-й группе выявлено значимое увеличение объема гепатоцитов в периферических и центральных зонах через 3 и 7 сут эксперимента, а через 28 сут, напротив, снижение в периферических зонах относительно животных интактных, 1-йи 2-й группы. Увеличение объема ядер гепатоцитов отмечалось на 3-и сутки после травмы в центральных и периферических, 7-еи 28-е сутки в центральных зонах (р<0,001) относительно интактной и 2-й группы (см. рис. 1). Снижение выявлено в периферических зонах на 28-е сутки (р<0,001) относительно интактной и 1-й группы. Повышение ЯЦИ отмечалось через 3 сут в периферических и промежуточных зонах (р<0,001) относительно интактной и 1-й группы, а через 7 и 28 сут, напротив, снижение в трех зонах печеночных долек (р<0,001) при сравнении с животными 1-йи 2-й группы (см. рис. 1, табл. 1). У мышей 2-й группы обнаружено значимое повышение содержания двуядерных форм гепатоцитов в центральных зонах печеночных долек на 28-е сутки восстановительного периода относительно нормы, но снижение относительно 1-й группы. Повышение митотической активности гепатоцитов выявлено через 3 сут (р<0,05) относительно животных интактной, 1-йи 3-й группы, а через 7 сут - значимое снижение (рис. 2, табл. 2). В 3-й группе обнаружено значимое снижение содержания двуядерных форм гепатоцитов через 3 сут после травмы в промежуточных, через 7 сут - центральных, промежуточных и периферических, через 28 сут - периферических и промежуточных зонах, но в центральных зонах, напротив, отмечалось их повышение (р<0,05) относительно нормы. Снижение митотической активности выявлено на 3-и сутки, повышение отмечалось на 7-еи 28-е сутки (р<0,05) относительно животных интактной, 1-йи 2-й группы (см. рис. 2, табл. 2). Обсуждение полученных данных. Существенные изменения морфометрических показателей гепатоцитов выявлены у мышей, находившихся на изокалорийном, обедненном белком рационе. Отмечалось увеличение митотического индекса гепатоцитов на первом этапе эксперимента и ЯЦИ при снижении объема клеток и их ядер в центральных, промежуточных и периферических зонах долек печени на всех этапах наблюдения (3-, 7-еи 28-е сутки). Возможно, структурные белки гепатоцитов, как лабильный резерв аминокислот [11], расходовались в процессе адаптивных перестроек организма для поддержания гомеостаза. Снижение интенсивности процессов синтеза внутриклеточных структур [11] является дополнительным стимулирующим фактором пролиферации гепатоцитов наряду с их гибелью [3], обусловленной внутриорганными гемодинамическими сдвигами (венозный стаз, отек стромы и гепатоцитов) после нарушения целостности кости [13]. Повышение митотического индекса и содержания двуядерных форм гепатоцитов может быть реализацией восстановительных резервов печени при функциональной недостаточности клеток паренхимы [2]. По нашему мнению, функциональная нагрузка на печень значительно повышается при действии двух факторов - повреждения костной ткани и обедненного белком изокалорийного рациона. При анализе эффективности применения аминокислотной смеси на течение репаративного процесса выявлены признаки внутриклеточной регенерации. Повышение ЯЦИ клеток в периферических и промежуточных зонах через 3 сут и размера их ядер в центральных зонах через 7 сут эксперимента свидетельствует о росте функциональной активности гепатоцитов, которая зависит от степени биологической и функциональной зрелости клеток и их топографического положения в печеночной дольке [10]. Отмеченная гипертрофия гепатоцитов в периферических и центральных зонах печеночной дольки может быть направлена как на усиление функции печени, так и подготовку клеток к делению [2]. С 7-х суток наблюдения митотическая активность гепатоцитов возрастала. Содержание двуядерных форм гепатоцитов повышалось в центральных зонах, но снижалось в периферических и промежуточных зонах, ЯЦИ соответствовал возрастной норме к концу наблюдения. Выявленные изменения являются следствием мобилизации компенсаторно-приспособительных процессов в органе для поддержания гомеостаза и функционального напряжения печени [2, 3]. Вероятно, применение незаменимых (лейцин, изолейцин и метионин) и полузаменимых (аргинин) аминокислот влияло на восстановительные процессы в печени, регулируя направленность метаболизма. При введении в рацион мышей аминокислотной смеси с 7-х суток эксперимента клеточный механизм регенерации сочетался с внутриклеточной регенерацией гепатоцитов. Источником репаративной регенерации печени у животных являются как периферическая, так и центральная зоны печеночной дольки. Таким образом, полученные данные дают основание полагать, что применение аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин и метионин в равных весовых соотношениях) оказывает стимулирующее влияние на развитие восстановительных процессов в печени. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: М. В. С. Сбор и обработка материала: Р. Ю. О. Статистическая обработка данных: Р. Ю. О. Анализ и интерпретация данных: Р. Ю. О., О. З. М. Написание текста: Р. Ю. О. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

R. Yu. Ocheretina

Russian G. A. Ilizarov Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: rufoch@mail.ru
Laboratory of Biochemistry 6 M. Ulyanova Str., Kurgan 6640014

O. Z. Mkrtchan

Omsk State Pedagogical University

Department of Biology and Biological Education 14 Naberezhnaya Tukhachevskogo, Omsk 644099

M. V. Stogov

Russian G. A. Ilizarov Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Laboratory of Biochemistry 6 M. Ulyanova Str., Kurgan 6640014

References

Supplementary files