НЕЙРОГЛОБИН В ГРУШЕВИДНЫХ НЕЙРОНАХ МОЗЖЕЧКА КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ

Полный текст

Холестаз, или застой желчи в желчевыводящих путях, нарушающий её отток из печени в двенадцатиперстную кишку и наступающий в результате желчекаменной болезни или другой патологии гепатобилиарной системы, в настоящее время широко распространён. Он сопровождается значительными нарушениями структуры и функций головного мозга и, в частности, вызывает повреждение митохондрий нейронов и, тем самым, вызывает окислительный стресс [2]. Поэтому актуальным является изучение механизмов эндогенной нейропротекции при данной патологии и, в частности, роли белка нейроглобина (Ngb). Он служит для депонирования и переноса кислорода к митохондриям нейронов, а при патологии предотвращает нейродегенерацию через антиоксидантные и антиапоптотические механизмы. Ngb участвует в транспорте кислорода и свободных радикалов в нейронах, способствуя поддержанию кислородного гомеостаза мозга при различных воздействиях. Он связывает и нейтрализует активные формы кислорода и азота, количество которых увеличивается при развитии оксидативного стресса, ишемии/гипоксии мозга, выступая как нейропротектор и регулятор клеточного дыхания [6]. Он обеспечивает защиту мозга от повреждений при ишемии-реперфузии благодаря своим антиоксидантным свойствам [9]. Ngb распознает ряд белков, участвующих в нескольких метаболических путях, включая поддержание ионного гомеостаза, энергетического метаболизма, функций митохондрий (апоптоз) и передачу клеточных сигналов. Нейрозащитные эффекты нейроглобина сводятся к шести основным путям, которые хорошо и подробно изложены в обзорах [16]. Нейроглобин экспрессируется в нейронах центральной и периферической нервной системы [7, 9], в том числе и в грушевидных нейронах (ГН) мозжечка [1, 6]. В наших предыдущих исследованиях установлено, что экспериментальный холестаз у крыс вызывает раннее повреждение митохондрий, глубокие структурные и метаболические нарушения в гистаминергических нейронах гипоталамуса [5], нейронах коры большого мозга [4], а также в ГН мозжечка, приводящие к их гибели [3]. Экспрессия нейроглобина в этих условиях не изучалась. Цель настоящей работы - оценка содержания нейроглобина в ГН мозжечка в разные сроки экспериментального холестаза у крыс. Материал и методы. В работе использован материал от 60 беспородных белых крыс-самцов массой 200±25 г. На проведение данных исследований получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 11.01.2017 г.). Животных содержали в стандартных условиях вивария. Крысам контрольной группы проводили лапаротомию без перевязки желчного протока. Подопытным животным производили перевязку общего желчного протока (ОЖП) на 3-5 мм ниже слияния долевых протоков двумя лигатурами с последующим пересечением между ними. Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 сут в утренние часы для синхронизации по времени животных выводили из эксперимента декапитацией. Быстро извлекали головной мозг. Для получения сопоставимых результатов кусочки коры мозжечка всех животных обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Кусочки фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде при +4 ºС в течение 20 ч, а затем заключали в парафин. Стандартные парафиновые срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) и монтировали на предметные стекла. Для иммуногистохимического выявления нейроглобина применяли первичные моноклональные мышиные антитела Anti-Neuroglobin antibody фирмы Abcam (Великобритания, ab. 37258) в разведении 1:600 при +4 ºС, экспозиция 20 ч, во влажной камере. Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор EXPOSE Mouse and Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit Abcam (Великобритания, ab. 80436). Изучение иммуногистохимических препаратов, их микрофотографирование и цитофотометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). Для исследования выбирали стандартные участки коры мозжечка (Ansiform lobule - Crus1; bregma - от -10,08 до -12,72 мм) [12]. Полученные результаты обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный № 31415926535897). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR). Cравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test). Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5 % (p<0,05). Результаты исследования. Результаты иммуногистохимического исследования нейроглобина в коре мозжечка крысы показали, что в молекулярном слое определяется умеренное гомогенное темно-коричневое иммуногистохимическое окрашивание цитоплазмы звёздчатых и корзинчатых нейронов на фоне слабо окрашенного нейропиля. В цитоплазме ГН продукты реакции располагаются гомогенно либо в виде мелких гранул, относительно равномерно распределенных по цитоплазме. В тех местах, где в срез попал апикальный дендрит, также прослеживается иммуногистохимическое окрашивание на некотором его протяжении. Содержание нейроглобина в цитоплазме перикарионов ГН даже у контрольных крыс значительно варьирует (рисунок, а, в). При этом средняя интенсивность иммуноокрашивания в разные сроки исследования варьировала незначительно (таблица). Ядра ГН иммунонегативны. В зернистом слое наблюдается умеренное иммуноокрашивание цитоплазмы нейронов, по размерам и локализации соответствующих клеткам Гольджи и клеткам-зернам. Установлено, что в цитоплазме перикарионов ГН мозжечка у подопытных животных через 2, 5 и 10 сут после перевязки общего жёлчного протока происходит снижение содержания нейроглобина на 14,9, 23,5 и 24,7 % соответственно (см. рисунок, б; таблицу). На 20-е сутки содержание нейроглобина снижается на 8,9 %, а на 45-е сутки, напротив, увеличивается на 17,8 %, эта же тенденция сохраняется и на 90-е сутки - увеличение на 7,8 % (см. рисунок, г; таблицу). Обсуждение полученных данных. Результаты настоящего исследования показали, что распределение иммунореактивности Ngb в структурах коры мозжечка крысы в целом соответствует таковому у человека [1]. Вместе с тем, у крысы умеренная Ngb-иммунореактивность обнаружена и в цитоплазме нейронов молекулярного и зернистого слоёв. После перевязки ОЖП по мере нарастания холестаза интенсивность иммуногистохимического окрашивания Ngb в цитоплазме перикарионов ГН мозжечка уменьшается, достигая минимальных значений на 10-е сутки. Эти изменения хорошо коррелируют с нарастающими (на 2-10-е сутки после перевязки ОЖП) морфофункциональными нарушениями в этих нейронах (структурными, ультраструктурными и гистохимическими), приводящими к гибели до 14 % ГН, что свидетельствует о срыве адаптации нейронов мозга и организма в целом [3]. Это сопровождается гибелью значительной части экспериментальных животных [2]. Как известно, нейроны из-за их высоких энергетических потребностей зависят от митохондрий, а дисфункция этих органелл играет ключевую роль в нарушении функций и гибели нейронов при острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы, нейродегенерации [8, 10]. В наших предыдущих исследованиях показано, что первые нарушения среди органелл ГН мозжечка при экспериментальном холестазе у крыс наблюдаются именно в митохондриях и состоят в разрушении их мембран, крист, набухании матрикса, снижении активности маркерных ферментов [3]. Поэтому мы полагаем, что одной из причин нейродегенерации и гибели нейронов при холестазе является раннее повреждение митохондрий. Возможно, эти нарушения в митохондриях нейронов связаны с уменьшением содержания в цитоплазме нейронов изучаемого кислородзапасающего и транспортирующего белка Ngb [7]. В наших предыдущих исследованиях также установлено, что на 45-90-е сутки после перевязки ОЖП у выживших животных в связи с прорастанием обходных желчевыводящих путей происходит нормализация структурных и гистохимических параметров в сохранившихся ГН мозжечка, в частности, состояния митохондрий и активности их маркерных ферментов [3]. Это совпадает по времени с накоплением нейроглобина в цитоплазме этих нейронов, что можно рассматривать как адаптационное изменение, направленное на повышение устойчивости нейронов к гипоксии, окислительному стрессу и нейродегенерации [9]. Подобное явление установлено и при изучении последствий экспериментальной ишемии головного мозга. Предполагают, что нейроглобин является важным фактором нейропротекции именно в отдаленные сроки ишемии [13]. У мышей после черепно-мозговой механической травмы показано, что избыточная экспрессия нейроглобина снижала сенсомоторный дефицит в отдалённые сроки после травмы [14]. Содержание Ngb было ниже в структурах спирального органа, имеющих признаки патологии, что предполагает участие Ngb в защитных механизмах при патологии внутреннего уха и наличии окислительного стресса. Предполагают, что Ngb проявляет своё протективное действие и посредством регуляции уровня апоптоза клеток мозга, связываясь с митохондриальными белками [6]. Молекулярные механизмы нейрозащитного действия нейроглобина при разных патологических состояниях в настоящее время интенсивно изучаются [16]. Вместе с тем, вопрос о возможности количественной оценки интенсивности иммуногистохимической реакции (фотометрического определения оптической плотности продукта реакции) остаётся дискуссионным. Это связано с тем, что оптическая плотность наиболее часто используемого в иммуногистохимии хромогена диаминобензидина (DAB) не всегда соответствует концентрации определяемого продукта. Это связано с оптическими свойствами самого DAB, который в высоких концентрациях не является истинным абсорбентом света, но может рассеивать его. Это значит, что он не следует закону Ламберта- Бэра, который описывает линейное соотношение между концентрацией вещества и его поглощающей способностью или оптической плотностью [15]. Действительно, эта погрешность возникает при высоких концентрациях DAB (тёмно-коричневая окраска структур), но когда интенсивность окраски умеренная и низкая (оптическая плотность хромогена ниже 0,6 единиц), то количественная оценка интенсивности окраски вполне возможна [11]. Поскольку в нашей работе средняя оптическая плотность иммунореактивных структур не превышала 0,35 единиц, полученные результаты можно считать значимыми. Следует отметить, что подобное ограничение существует и для продуктов большинства других гистохимических реакций. Таким образом, после перевязки ОЖП экспрессия нейроглобина в перикарионах ГН мозжечка меняется волнообразно: она значительно понижена в условиях холестаза на 2-20-е сутки после перевязки ОЖП (минимум на 5-10-е сутки) и повышена при самоустранении холестаза на 45-90-е сутки опыта (максимум на 45-е сутки). Источник финансирования: бюджетные средства и средства университета на экспериментальных животных и реактивы. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. М. З., С. В. Е. Сбор и обработка материала: О. А. К., С. В. Е. Статистическая обработка данных: С. В. Е. Написание и редактирование текста: С. В. Е., С. М. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Сергей Владимирович Емельянчик

Гродненский государственный университет им. Я. Купалы

Email: semel@grsu.by
кафедра зоологии и физиологии человека и животных 230012, Беларусь, г. Гродно, пер. Доватора, 3/1

Ольга Анатольевна Карнюшко

Гродненский государственный медицинский университет

кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии 230015, Беларусь. г. Гродно, ул. Горького, 80

Сергей Михайлович Зиматкин

Гродненский государственный медицинский университет

кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии 230015, Беларусь. г. Гродно, ул. Горького, 80

Список литературы

Дополнительные файлы