NEUROGLOBIN IN CEREBELLAR PURKINJE CELLS OF RATS WITH CHOLESTASIS

Full Text

Холестаз, или застой желчи в желчевыводящих путях, нарушающий её отток из печени в двенадцатиперстную кишку и наступающий в результате желчекаменной болезни или другой патологии гепатобилиарной системы, в настоящее время широко распространён. Он сопровождается значительными нарушениями структуры и функций головного мозга и, в частности, вызывает повреждение митохондрий нейронов и, тем самым, вызывает окислительный стресс [2]. Поэтому актуальным является изучение механизмов эндогенной нейропротекции при данной патологии и, в частности, роли белка нейроглобина (Ngb). Он служит для депонирования и переноса кислорода к митохондриям нейронов, а при патологии предотвращает нейродегенерацию через антиоксидантные и антиапоптотические механизмы. Ngb участвует в транспорте кислорода и свободных радикалов в нейронах, способствуя поддержанию кислородного гомеостаза мозга при различных воздействиях. Он связывает и нейтрализует активные формы кислорода и азота, количество которых увеличивается при развитии оксидативного стресса, ишемии/гипоксии мозга, выступая как нейропротектор и регулятор клеточного дыхания [6]. Он обеспечивает защиту мозга от повреждений при ишемии-реперфузии благодаря своим антиоксидантным свойствам [9]. Ngb распознает ряд белков, участвующих в нескольких метаболических путях, включая поддержание ионного гомеостаза, энергетического метаболизма, функций митохондрий (апоптоз) и передачу клеточных сигналов. Нейрозащитные эффекты нейроглобина сводятся к шести основным путям, которые хорошо и подробно изложены в обзорах [16]. Нейроглобин экспрессируется в нейронах центральной и периферической нервной системы [7, 9], в том числе и в грушевидных нейронах (ГН) мозжечка [1, 6]. В наших предыдущих исследованиях установлено, что экспериментальный холестаз у крыс вызывает раннее повреждение митохондрий, глубокие структурные и метаболические нарушения в гистаминергических нейронах гипоталамуса [5], нейронах коры большого мозга [4], а также в ГН мозжечка, приводящие к их гибели [3]. Экспрессия нейроглобина в этих условиях не изучалась. Цель настоящей работы - оценка содержания нейроглобина в ГН мозжечка в разные сроки экспериментального холестаза у крыс. Материал и методы. В работе использован материал от 60 беспородных белых крыс-самцов массой 200±25 г. На проведение данных исследований получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 11.01.2017 г.). Животных содержали в стандартных условиях вивария. Крысам контрольной группы проводили лапаротомию без перевязки желчного протока. Подопытным животным производили перевязку общего желчного протока (ОЖП) на 3-5 мм ниже слияния долевых протоков двумя лигатурами с последующим пересечением между ними. Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 сут в утренние часы для синхронизации по времени животных выводили из эксперимента декапитацией. Быстро извлекали головной мозг. Для получения сопоставимых результатов кусочки коры мозжечка всех животных обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Кусочки фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде при +4 ºС в течение 20 ч, а затем заключали в парафин. Стандартные парафиновые срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) и монтировали на предметные стекла. Для иммуногистохимического выявления нейроглобина применяли первичные моноклональные мышиные антитела Anti-Neuroglobin antibody фирмы Abcam (Великобритания, ab. 37258) в разведении 1:600 при +4 ºС, экспозиция 20 ч, во влажной камере. Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор EXPOSE Mouse and Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit Abcam (Великобритания, ab. 80436). Изучение иммуногистохимических препаратов, их микрофотографирование и цитофотометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). Для исследования выбирали стандартные участки коры мозжечка (Ansiform lobule - Crus1; bregma - от -10,08 до -12,72 мм) [12]. Полученные результаты обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный № 31415926535897). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR). Cравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test). Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5 % (p<0,05). Результаты исследования. Результаты иммуногистохимического исследования нейроглобина в коре мозжечка крысы показали, что в молекулярном слое определяется умеренное гомогенное темно-коричневое иммуногистохимическое окрашивание цитоплазмы звёздчатых и корзинчатых нейронов на фоне слабо окрашенного нейропиля. В цитоплазме ГН продукты реакции располагаются гомогенно либо в виде мелких гранул, относительно равномерно распределенных по цитоплазме. В тех местах, где в срез попал апикальный дендрит, также прослеживается иммуногистохимическое окрашивание на некотором его протяжении. Содержание нейроглобина в цитоплазме перикарионов ГН даже у контрольных крыс значительно варьирует (рисунок, а, в). При этом средняя интенсивность иммуноокрашивания в разные сроки исследования варьировала незначительно (таблица). Ядра ГН иммунонегативны. В зернистом слое наблюдается умеренное иммуноокрашивание цитоплазмы нейронов, по размерам и локализации соответствующих клеткам Гольджи и клеткам-зернам. Установлено, что в цитоплазме перикарионов ГН мозжечка у подопытных животных через 2, 5 и 10 сут после перевязки общего жёлчного протока происходит снижение содержания нейроглобина на 14,9, 23,5 и 24,7 % соответственно (см. рисунок, б; таблицу). На 20-е сутки содержание нейроглобина снижается на 8,9 %, а на 45-е сутки, напротив, увеличивается на 17,8 %, эта же тенденция сохраняется и на 90-е сутки - увеличение на 7,8 % (см. рисунок, г; таблицу). Обсуждение полученных данных. Результаты настоящего исследования показали, что распределение иммунореактивности Ngb в структурах коры мозжечка крысы в целом соответствует таковому у человека [1]. Вместе с тем, у крысы умеренная Ngb-иммунореактивность обнаружена и в цитоплазме нейронов молекулярного и зернистого слоёв. После перевязки ОЖП по мере нарастания холестаза интенсивность иммуногистохимического окрашивания Ngb в цитоплазме перикарионов ГН мозжечка уменьшается, достигая минимальных значений на 10-е сутки. Эти изменения хорошо коррелируют с нарастающими (на 2-10-е сутки после перевязки ОЖП) морфофункциональными нарушениями в этих нейронах (структурными, ультраструктурными и гистохимическими), приводящими к гибели до 14 % ГН, что свидетельствует о срыве адаптации нейронов мозга и организма в целом [3]. Это сопровождается гибелью значительной части экспериментальных животных [2]. Как известно, нейроны из-за их высоких энергетических потребностей зависят от митохондрий, а дисфункция этих органелл играет ключевую роль в нарушении функций и гибели нейронов при острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы, нейродегенерации [8, 10]. В наших предыдущих исследованиях показано, что первые нарушения среди органелл ГН мозжечка при экспериментальном холестазе у крыс наблюдаются именно в митохондриях и состоят в разрушении их мембран, крист, набухании матрикса, снижении активности маркерных ферментов [3]. Поэтому мы полагаем, что одной из причин нейродегенерации и гибели нейронов при холестазе является раннее повреждение митохондрий. Возможно, эти нарушения в митохондриях нейронов связаны с уменьшением содержания в цитоплазме нейронов изучаемого кислородзапасающего и транспортирующего белка Ngb [7]. В наших предыдущих исследованиях также установлено, что на 45-90-е сутки после перевязки ОЖП у выживших животных в связи с прорастанием обходных желчевыводящих путей происходит нормализация структурных и гистохимических параметров в сохранившихся ГН мозжечка, в частности, состояния митохондрий и активности их маркерных ферментов [3]. Это совпадает по времени с накоплением нейроглобина в цитоплазме этих нейронов, что можно рассматривать как адаптационное изменение, направленное на повышение устойчивости нейронов к гипоксии, окислительному стрессу и нейродегенерации [9]. Подобное явление установлено и при изучении последствий экспериментальной ишемии головного мозга. Предполагают, что нейроглобин является важным фактором нейропротекции именно в отдаленные сроки ишемии [13]. У мышей после черепно-мозговой механической травмы показано, что избыточная экспрессия нейроглобина снижала сенсомоторный дефицит в отдалённые сроки после травмы [14]. Содержание Ngb было ниже в структурах спирального органа, имеющих признаки патологии, что предполагает участие Ngb в защитных механизмах при патологии внутреннего уха и наличии окислительного стресса. Предполагают, что Ngb проявляет своё протективное действие и посредством регуляции уровня апоптоза клеток мозга, связываясь с митохондриальными белками [6]. Молекулярные механизмы нейрозащитного действия нейроглобина при разных патологических состояниях в настоящее время интенсивно изучаются [16]. Вместе с тем, вопрос о возможности количественной оценки интенсивности иммуногистохимической реакции (фотометрического определения оптической плотности продукта реакции) остаётся дискуссионным. Это связано с тем, что оптическая плотность наиболее часто используемого в иммуногистохимии хромогена диаминобензидина (DAB) не всегда соответствует концентрации определяемого продукта. Это связано с оптическими свойствами самого DAB, который в высоких концентрациях не является истинным абсорбентом света, но может рассеивать его. Это значит, что он не следует закону Ламберта- Бэра, который описывает линейное соотношение между концентрацией вещества и его поглощающей способностью или оптической плотностью [15]. Действительно, эта погрешность возникает при высоких концентрациях DAB (тёмно-коричневая окраска структур), но когда интенсивность окраски умеренная и низкая (оптическая плотность хромогена ниже 0,6 единиц), то количественная оценка интенсивности окраски вполне возможна [11]. Поскольку в нашей работе средняя оптическая плотность иммунореактивных структур не превышала 0,35 единиц, полученные результаты можно считать значимыми. Следует отметить, что подобное ограничение существует и для продуктов большинства других гистохимических реакций. Таким образом, после перевязки ОЖП экспрессия нейроглобина в перикарионах ГН мозжечка меняется волнообразно: она значительно понижена в условиях холестаза на 2-20-е сутки после перевязки ОЖП (минимум на 5-10-е сутки) и повышена при самоустранении холестаза на 45-90-е сутки опыта (максимум на 45-е сутки). Источник финансирования: бюджетные средства и средства университета на экспериментальных животных и реактивы. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. М. З., С. В. Е. Сбор и обработка материала: О. А. К., С. В. Е. Статистическая обработка данных: С. В. Е. Написание и редактирование текста: С. В. Е., С. М. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

S. V. Yemelyanchik

Yanka Kupala Grodno State University

Email: semel@grsu.by
Department of Zoology and Human and Animal Physiology 3/1 Dovatora Ln., Grodno 230012, Belarus

O. A. Karnyushko

Grodno State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorkiy St., Grodno 230015, Belarus

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorkiy St., Grodno 230015, Belarus

References

Supplementary files