ВЛИЯНИЕ СЕЛАНКА НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕЧЕНИ КРЫС НА ФОНЕ СТРЕССА

Полный текст

В настоящее время негативное влияние стресса на состояние печени показано во многих исследованиях. В частности, хроническая иммобилизация, вызывающая выраженную эмоционально-негативную реакцию, оказывает значительное влияние на развитие неалкогольной жировой болезни печени, проявляющейся очагами воспалительной инфильтрации, развитием фокальных некрозов с нарушением структуры печеночной дольки и, как следствие, усилением процессов фиброзного замещения активной паренхимы печени [9, 12]. Также стрессиндуцированное увеличение уровня катехоламинов и глюкокортикостероидов вызывает нарушение микроциркуляции в дольке и усиление процессов перекисного окисления [10], что сопровождается повреждением белков и молекул ДНК и морфологически проявляется в виде гидропической и/или жировой дистрофии [12, 14]. В связи с этим интерес представляет исследование морфофункционального состояния гепатоцитов на фоне применения фармакологических препаратов с противострессорным действием, в частности, анксиолитиков на основе регуляторных пептидов. Известно, что регуляторные пептиды с нейротропным действием способны вызывать морфофункциональные изменения в печени [8]. Одним из представителей данной группы является препарат «Селанк», который обладает выраженными анксиолитическими и антидепрессантными [1], адаптогенными свойствами [5], снижает ульцерогенное действие стресса [4], принимает участие в регуляции воспалительной реакции [3] и нормализует процессы свободнорадикального окисления в печени [7], что и обусловило выбор его для исследования как препарата, потенциально лимитирующего повреждающее действие стресса на гепатоциты. С учетом вышеизложенного, целью данной работы являлось изучение влияния селанка на структуру паренхимы печени крыс на фоне моделирования хронического иммобилизационного стресса в эксперименте. Материал и методы. Эксперименты выполнены на крысах-самцах породы Вистар массой 250-280 г (n=50), разделенных на группы по 10 животных. 1-й группе внутрибрюшинно вводили изотонический раствор NaCl, 2-я группа получала изотонический раствор NaCl на фоне стрессирования, 3-, 4-яи 5-я - селанк в различных дозировках на фоне стрессирования. Животные содержались в условиях вивария и получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе при 12-часовом световом режиме и контролируемой температуре воздуха (22±2 ºС). Все исследования проводили с соблюдением принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным и в соответствии с решением этического комитета Курского государственного медицинского университета (протокол № 4 от 08.04.2012 г). В работе использовали гептапептид селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro), синтезированный в ФГБУН «Институт молекулярной генетики» Российской академии наук. Препарат растворяли в изотоническом растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно за 15 мин до начала стрессорного воздействия в дозах 100, 300 и 1000 мкг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентные объемы изотонического раствора NaCl из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Забой животных и забор материала проводили на 5-е сутки от начала исследования. Хронический иммобилизационный стресс (ХИС) создавали путем помещения крыс в индивидуальные пластиковые боксы, соответствующие размерам животных. Иммобилизацию проводили в течение 2 ч на протяжение 5 дней. По окончании иммобилизации животных выводили из эксперимента обескровливанием под эфирным наркозом путем забора крови из правого желудочка сердца. Состояние гепатоцитов и распределение поражения в отделах печеночной дольки оценивали по микрофотографиям парафиновых срезов толщиной 5-7 мкм, окрашенных гематоксилином - эозином (3 среза от каждого животного). Морфометрическое исследование было проведено после создания электронной галереи изображений с помощью полуавтоматического сканера Mirax Desk (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия). С помощью программы для просмотра сканированных изображений PannoramicViewer 1.15.4 (3DHISTECH ltd, Венгрия) оценивали площади гепатоцитов и их ядер в выборке из 100 клеток центрального и периферического отделов печеночных долек в нескольких непересекающихся полях зрения каждого препарата при увеличении 400. Расчет площади цитоплазмы и ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО) производили в программе MS Excel. Подсчет одно-и многоядерных, одно-и многоядрышковых гепатоцитов в центральном и периферическом отделах дольки проводили с помощью пакета программ ImageJ. После определения типа распределения данных с помощью вычисления стандартных описательных статистических показателей (среднее арифметическое, стандартное отклонение, мода, медиана, скос и эксцесс) и установления факта несоответствия распределения характеристикам кривой нормального распределения данных для подтверждения статистической гипотезы применяли вычисление критерия Манна-Уитни. Результаты исследования. Установлено, что при гистологическом исследовании препаратов печени стрессированных животных (2-я группа) наблюдались признаки выраженной гидропической дистрофии гепатоцитов на всем протяжении печеночной дольки, более выраженные на периферии (рисунок, а). Моделирование ХИС вызывало значимое снижение числа многоядрышковых гепатоцитов на 1,5 % (р<0,05) в периферическом отделе дольки (табл. 1), а также увеличение площадей гепатоцитов как периферического, так и центрального отделов (на 4,9 и 4,5 % соответственно), за счет роста площадей как цитоплазмы (на 5,1 и 5,6 % соответственно), так и ядра (на 5,6 и 2,4 % соответственно) (табл. 2). Применение селанка на фоне стрессорного воздействия оказывало дозозависимое корригирующее влияние на морфофункциональное состояние гепатоцитов в виде снижения выраженности белковой дистрофии. Так, при введении селанка в дозе 100 мг/кг отмечалось уменьшение проявлений гидропической дистрофии преимущественно в периферическом отделе дольки. Однако в гепатоцитах центрального отдела сохранялись признаки гиалиново-капельной дистрофии (см. рисунок, б). При использовании селанка в дозе 300 мг/ кг корригирующий эффект был более выраженным - отмечались лишь остаточные явления внутриклеточного гиалиноза в виде умеренной зернистости цитоплазмы гепатоцитов преимущественно на периферии печеночной дольки (см. рисунок, в). В случае увеличения вводимой дозы препарата до 1000 мг/кг признаки белковой дистрофии практически отсутствовали (см. рисунок, г). На исследованные морфометрические показатели селанк оказывал дозозависимое влияние, которое по направленности было противоположным эффектам, индуцированным стрессом. Так, введение селанка в дозе 1000 мкг/кг вызвало достоверное увеличение числа одноядерных гепатоцитов. Использование селанка во всех исследуемых дозах сопровождалось достоверным повышением до уровня у нестрессированных животных числа многоядрышковых гепатоцитов в периферическом отделе дольки (см. табл. 1), а также снижением площади гепатоцитов периферического и центрального отделов за счет уменьшения площади цитоплазмы (см. табл. 2). Площадь ядра при этом значимо не изменялась за исключением использования селанка в дозе 100 мкг/кг, при котором установлено снижение площади ядра на 14 % (р<0,01), что вело к статистически значимому увеличению ЯЦО клеток во всех группах, получавших селанк. Вышеуказанные изменения носили дозозависимый характер и были наиболее выражены при использовании селанка в дозе 1000 мкг/кг: в периферическом отделе площадь гепатоцитов снизилась на 21 %, площадь цитоплазмы - на 26 %, ЯЦО увеличилось на 37 %; в центральном отделе площадь гепатоцитов уменьшилась на 27 %, площадь их цитоплазмы - на 32 %, ЯЦО увеличилось на 45 % (р<0,01). Обсуждение полученных дан ных. На основании полученных данных, можно заключить, что использованная в работе модель стрессорного воздействия путем многократной иммобилизации крыс способствует развитию гидропической дистрофии гепатоцитов, а также перестройки их нуклеарного аппарата, проявляющейся увеличением числа одноядрышковых клеток в периферическом отделе дольки. Введение селанка стрессированным животным оказывало дозозависимое стресслимитирующее влияние на морфофункциональное состояние гепатоцитов. В основе данного эффекта селанка может лежать его выраженный анксиолитический эффект, обусловленный усилением процессов торможения пирамидных нейронов гиппокампа [6] вследствие увеличения плотности тормозных ГАМКА -рецепторов [1], регуляции метаболизма моноаминов [2]. Снижение уровня тревожности потенциально уменьшает уровень активации гипоталамо-гипофизарной оси и способствует компенсации стрессовых изменений. Способность селанка ингибировать процессы перекисного окисления в тканях печени, установленная у крыс при использовании аналогичной модели стресса [7], также могла ограничивать развитие дистрофических процессов гепатоцитов. Длительное стрессиндуцированное повышение уровня глюкокортикостероидов приводит к гипертрофии гепатоцитов [13], что может объяснять увеличение площадей гепатоцитов и их ядер. Незначительная степень изменения данных показателей может свидетельствовать об адаптации животных к стрессорному воздействию из-за небольшой продолжительности сеансов иммобилизации. Изменение кариоцитоплазматических показателей гепатоцитов на фоне введения пептида (повышение ЯЦО за счет уменьшения площади цитоплазмы) может свидетельствовать о меньшей степени их дифференцировки вследствие усиления процессов пролиферации. На данное обстоятельство может указывать и снижение числа многоядерных клеток при введении пептида в дозе 1000 мкг/кг. Процессы пролиферации гепатоцитов ингибируются глюкокортикостероидами и регулируются сигнальными воздействиями клеток микроокружения, в том числе клеток Купфера [13]. J. Fu и соавт. показали значимую роль усиленного de novo синтеза серотонина и экспрессии серотониновых рецепторов гепатоцитами в развитии опосредованных стероидами эффектов хронического иммобилизационного стресса [14]. Учитывая способность селанка регулировать обмен серотонина за счет влияния на активность триптофангидроксилазы [2], можно предположить, что он ослабляет ингибирующие влияния глюкокортикостероидов на пролиферацию гепатоцитов. Одним из возможных механизмов стимуляции пептидом деления гепатоцитов может быть прямое влияние селанка на клетки Купфера, учитывая его влияние на экспрессию генов иммунокомпетентных клеток [3]. Однако для подтверждения данного предположения необходимо проведение дополнительных исследований, в частности, по изучению взаимодействия пептида с рецепторами гепатоцитов. Таким образом, на основании полученных данных, можно заключить, что внутрибрюшинное введение селанка крысам в условиях хронического иммобилизационного стресса оказывает стресслимитирующее и гепатопротекторное действие, проявляющееся снижением выраженности гидропической дистрофии и усилением процессов пролиферации гепатоцитов с наибольшей выраженностью эффектов при применении пептида в дозе 1000 мкг/кг. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Е. В. Ф., И. И. Б, А. В. И., Л. А. А., Н. Ф. М. Сбор и обработка материала: Е. В. Ф., А. Е. Б. Статистическая обработка данных: Е. В. Ф., А. Е. Б, И. И. Б. Анализ и интерпретация данных: Е. В. Ф., А. В. И., И. И. Б., А. Е. Б. Написание текста: Е. В. Ф., А. В. И., И. И. Б., А. Е. Б., Л. А. А., Н. Ф. М. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Екатерина Владимировна Фоменко

Курский государственный медицинский университет

кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3

Александр Викторович Иванов

Курский государственный медицинский университет

кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии; НИИ общей патологии 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3

Игорь Иванович Бобынцев

Курский государственный медицинский университет

Email: bobig@mail.ru
кафедра патофизиологии, НИИ общей патологии; НИИ общей патологии 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3

Андрей Евгеньевич Белых

Курский государственный медицинский университет

кафедра патофизиологии, НИИ общей патологии; НИИ общей патологии 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3

Людмила Александровна Андреева

Институт молекулярной генетики

отдел химии физиологически активных веществ 123182, Москва, пл. акад. Курчатова, 2

Николай Федорович Мясоедов

Институт молекулярной генетики

отдел химии физиологически активных веществ 123182, Москва, пл. акад. Курчатова, 2

Список литературы

Дополнительные файлы