МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛЕЙ ГИППОКАМПА ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИИ

Полный текст

Транзиторная ишемия головного мозга может сопровождаться селективной гибелью нейронов в наиболее чувствительных к ней отделах головного мозга, к которым относятся поле СА1 гиппокампа, кора большого мозга и стриатум [14, 29]. При наступлении ишемии в клетке запускается цепь процессов, известных под названием ишемического каскада, первым и важнейшим звеном которой является внутриклеточный энергодефицит. Итогом развертывания ишемического каскада являются глубокие нарушения ионного гомеостаза нейронов, внутриклеточный отек и разрушение плазмолеммы, а также запуск механизмов программируемой клеточной гибели. Многочисленные исследования подтверждают гипотезу о том, что постишемическая реперфузия головного мозга даже после относительно непродолжительной ишемии приводит к дополнительным нарушениям энергетического метаболизма клетки, которые могут выражаться в дисфункции митохондрий и изменении активности митохондриальных ферментов [22, 29]. В исследовании, проведенном на митохондриях, изолированных из нейронов гиппокампа и стриатума у крыс в разные сроки после 15-минутной глобальной ишемии головного мозга, было обнаружено, что выраженность дисфункции митохондрий различается в зависимости от их локализации. Так, митохондрии из синаптических терминалей были в наибольшей степени повреждены непосредственно после ишемии, тогда как несинаптосомальные митохондрии характеризовались меньшей чувствительностью к ишемии, причем степень их дисфункции достигала максимума только в позднем реперфузионном периоде [9]. Интенсивность гибели нейронов, вызванной кратковременной ишемией с последующей реперфузией резко нарастает через 48 ч с момента реперфузии, что объясняется отсроченной гибелью нейронов [14]. Очевидно, что в основе необратимого повреждения нейронов лежат глубокие нарушения энергетического обмена. Однако механизмы, связывающие нарушения энергетического метаболизма нейронов с характерной для феномена отсроченной гибели динамикой потери нейронов, остаются малоизученными. Результаты исследований показывают, что апоптоз нейронов может способствовать увеличению размера инфаркта головного мозга в отдаленном периоде после повреждения, вызванного как транзиторной, так и перманентной фокальной его ишемией [12, 18]. На гомогенатах различных зон гиппокампа у крысы было показано, что через 48 ч реперфузии после ишемии головного мозга утилизация кислорода была значимо снижена в поле СА1 гиппокампа, но при этом не отличалась от исходной в полях СА3 и СА4 [24]. Эндогенным механизмом, позволяющим снизить степень реперфузионного повреждения, может выступать ишемическое посткондиционирование (ИПостК), цитопротективный потенциал которого реализуется при выполнении коротких ишемических стимулов в раннем реперфузионном периоде после пролонгированной ишемии головного мозга. Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению нейропротективных эффектов ИПостК, механизмы реализации его защитного эффекта остаются не до конца изученными [30]. Также остается неизученным влияние коротких ишемических стимулов, выполненных в раннем реперфузионном периоде, на энергетический метаболизм нейронов, обладающих различной чувствительностью к ишемическому повреждению. Предполагается, что главным механизмом, лежащим в основе нейропротективного эффекта ИПостК, является воздействие ишемических стимулов на энергетический баланс клетки путем влияния на ключевые ферменты окислительновосстановительных реакций. Недавно было показано влияние ИПостК на активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в цитоплазме нейронов при глобальном ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга [4]. Однако остается неизученной роль митохондриальных окислительно-восстановительных ферментов при применении ИПостК. Одним из ключевых ферментов, участвующих в энергетическом метаболизме клетки, является сукцинатдегидрогеназа (СДГ), которая локализуется на внутренней мембране митохондрий, одновременно является ферментом цикла Кребса и входит в состав комплекса электрон-транспортной цепи [10]. Известно, что изменение активности СДГ используется как маркер динамики окислительно-восстановительных реакций в клетках, а также как маркер стресса [3]. Роль СДГ в формировании толерантности головного мозга к реперфузионному повреждению при применении ИПостК в областях головного мозга с различной чувствительностью к ишемии—реперфузии остается неизученной. Цель настоящей работы — исследование влияния ИПостК на жизнеспособность нейронов различных полей гиппокампа и активность СДГ в их цитоплазме при глобальной ишемии—реперфузии головного мозга у монгольских песчанок. Материал и методы. Все эксперименты были проведены в соответствии с рекомендациями этических комитетов Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова и Федерального центра сердца, крови иэндокринологии им. В. А. Алмазова, а также в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья США № 85-23). Исследование выполнено на песчанках-самцах (Meriones unguiculatus) массой 60–80 г, наркотизированных хлоралгидратом (450 мг/кг, внутрибрюшинно). В первой группе животных (Ишемия, n=10) моделировали обратимую глобальную ишемию головного мозга путем двусторонней окклюзии общих сонных артерий на 7 мин с последующей реперфузией в течение 48 ч. Во второй группе песчанок (Ишемия+ИПостК, n=10) проводили ИПостК — 3 эпизода реперфузии/ишемии по 15 c/15 с, выполненных непосредственно после завершения 7-минутной ишемии. Третью группу составили ложнооперированные (ЛО) животные (n=10), которым выполняли все хирургические манипуляции, кроме окклюзии общих сонных артерий. Через 48 ч по 5 животных из каждой группы наркотизировали повторно, извлекали головной мозг (ГМ), выделяли части, содержащие гиппокамп, фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Для общегистологической оценки фронтальные срезы толщиной 5 мкм, соответствующие стереотаксическому атласу монгольской песчанки (bregma 1,5–1,9 мм) [19], окрашивали гематоксилином – эозином. Для морфометрического анализа препараты окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля, на которых под световым микроскопом ДМ-750 (Leica, Германия) на нескольких срезах гиппокампа при увеличении 400 подсчитывали количество неизмененных пирамидных нейронов в полях СА1, СА2, СА3 и СА4. Полученный показатель пересчитывали на 1 мм пирамидного слоя гиппокампа. Учитывали нейроны, содержащие в плоскости среза ядрышко [4, 14]. У остальных 5 животных каждой группы аналогичным образом выделяли части ГМ, содержащие гиппокамп, после чего их ступенчато замораживали, проводя через охлажденный изооктан в жидком азоте. На криостатных срезах толщиной 10 мкм количественно оценивали активность СДГ тетразолиевым методом [2]. Оптическую плотность продукта реакции определяли с помощью спектроцитофотометра (ЛОМО, Россия) плаг-методом при увеличении 280, площадь кончика зонда составляла 0,785 мкм2, длина волны — 545 нм [1]. Результаты цитофотометрического анализа выражали в относительных единицах (отн. ед.) оптической плотности (D). Проводили по 50 измерений D в цитоплазме неизмененных нейронов пирамидного слоя полей СА1, СА2, СА3, СА4 на препарате у каждого животного. Результаты обрабатывали статистически с вычислением среднего арифметического и его стандартной ошибки. Значимость различий между группами оценивали с помо щью t-критерия Стьюдента с использованием программы «SТATISTICA 6.0». Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. В группе ЛО-животных мелкие клетки пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа располагались в 4–5 слоев. Для поля СА2 гиппокампа было характерно более рыхлое расположение клеток в 3–4 слоя, тела пирамидных нейронов были несколько крупнее, чем в поле СА1. Пирамидный слой поля СА3 гиппокампа характеризовался наличием крупных нейронов, рыхло расположенных в 4–5 слоев. В поле СА4 пирамидный слой был представлен крупными нейронами, расположенными очень рыхло в 5–6 слоев (рисунок). Плотность расположения нейронов в различных полях гиппокампа представлена в табл. 1. При морфологическом изучении гиппокампа в группе ЛО-животных не наблюдалось дистрофических изменений или уменьшения количества неизмененных пирамидных нейронов. Через 48 ч после моделирования глобальной ишемии во всех полях гиппокампа отмечались перицеллюлярный отек и наличие клеток с морфологическими изменениями. В поле СА1 происходила более значительная гибель нейронов. Число неизмененных нейронов в данном поле уменьшалось на 76% (P<0,01) по сравнению с таковым в группе ЛО животных (см. табл. 1). Обратимая ишемия приводила к уменьшению количества нейронов в поле СА2 на 6% по сравнению с их числом в группе ЛО. В поле СА3 количество неизмененных нейронов было на 46% меньше, чем в группе ЛО-животных (P<0,01) (см. табл. 1). К концу 2-х суток реперфузии в поле СА4 количество нейронов уменьшалось на 14%, что значимо не отличалось от такового в группе ЛО (см. табл. 1). В группе животных с применением ИПостК отмечалось значимое (P<0,01) увеличение числа неизмененных нейронов в полях гиппокампа СА1 (в 2,2 раза) и СА3 (в 1,6 раза) по сравнению с таковым в группе после ишемии. В поле СА2 и СА4 имелась тенденция к проявлению протективного эффекта ИПостК в виде сохранения количества неизмененных нейронов. Их число в поле СА2 и СА4 было на 1,5 и 6,9% выше, чем в группе после ишемии (P>0,05) (см. рис. 1, табл. 1). В группе ЛО-животных активность СДГ в цитоплазме пирамидных нейронов была различной в зависимости от поля гиппокампа. Самая высокая активность СДГ была зарегистрирована в цитоплазме нейронов поля СА3. Активность СДГ в цитоплазме нейронов поля СА1 была на 17,6% меньше, чем в нейронах поля СА3 и значимо ниже (P<0,05), чем в нейронах остальных полей гиппокампа (табл. 2). Таким образом, активность СДГ в цитоплазме нейронов у ЛО-животных зависела от принадлежности нейрона к определенному полю гиппокампа и распределялась в следующем порядке: СА3>СА2>СА4>СА1. В группе животных после ишемии активность СДГ значимо нарастала во всех полях гиппокампа по сравнению с таковой в группе ЛО (см. табл. 2). Однако увеличение активности фермента имело неоднородный характер. Самое существенное повышение активности СДГ на 45,3% наблюдалось в цитоплазме нейронов поля СА2 и было значимо выше, чем в других полях гиппокампа после обратимой ишемии (см. табл. 2). В цитоплазме нейронов поля СА1 активность СДГ увеличивалась на 38,3%. Активность СДГ в нейронах поля СА4 также значимо повышалась на 15,4% (P<0,01), а в поле СА3 — только на 12,3% (см. табл. 2). Через 48 ч после моделирования 7-минутной обратимой ишемии активность СДГ в цитоплазме пирамидных нейронов распределялась в следующем порядке: СА2>СА3>СА1>СА4. Применение ИПостК приводило к уменьшению активности СДГ во всех полях гиппокампа по сравнению с таковой в группе после ишемии (см. табл. 2). В цитоплазме нейронов поля СА1 гиппокампа активность СДГ при применении ИПостК значимо (P<0,05) понижалась на 15% по сравнению с ее активностью в группе после ишемии и оставалась значимо выше по сравнению с таковой в группе ЛО. В цитоплазме нейронов поля СА2 активность СДГ понижалась на 22% по сравнению с активностью в группе после ишемии, но также оставалась значимо выше при сравнении с таковой в группе ЛО (см. табл. 2). Активность СДГ в цитоплазме нейронов полей СА3 и СА4 понижалась на 7,8 и 15% соответственно по сравнению с активностью в группе после ишемии и была неотличима от таковой в группе ЛО. При применении ИПостК после обратимой 7-минутной ишемии активность СДГ в цитоплазме пирамидных нейронов распределялась в следующем порядке: СА2>СА3> СА1>СА4, т. е. сохранялось то же соотношение активности СДГ в разных полях гиппокампа, что и в группе после ишемии, но уровни активности СДГ довольно равномерно понижались под действием ИПостК. Обсуждение полученных данных. Структура полей гиппокампа монгольских песчанок (Meriones unguiculatus) типична для головного мозга грызунов [14, 18, 29]. В нашем исследовании анализ активности СДГ в различных полях гиппокампа у ЛО-животных выявил, что наименьшая активность фермента характерна для нейронов поля СА1. Этот результат согласуется с данными, полученными ранее другими исследователями при изучении гиппокампа песчанок [16]. Поскольку активность СДГ коррелирует с уровнем продукции в клетке высокоэнергетических фосфатов, было высказано предположение о том, что низкая активность ферментов электрон-транспортной цепи в нейронах поля СА1 может играть ключевую роль в запуске их отсроченной гибели при реперфузии и объяснять их низкую толерантность к ишемии—реперфузии [16]. Однако при исследовании активности СДГ в различных полях гиппокампа кроликов такой закономерности обнаружить не удалось [23]. При иммуногистохимическом анализе пирамидного слоя гиппокампа у крыс было установлено, что в поле СА1 интенсивность реакции пируватдегидрогеназного комплекса ниже, чем в поле СА3 [6]. При исследовании локальной утилизации глюкозы в гиппокампе у крыс также была обнаружена наименьшая ее интенсивность в поле СА1, а наивысшая — в поле СА3 [27]. Исходя из результатов данной работы, а также ряда других исследований [6, 16, 24] можно предположить, что самый низкий уровень энергетического метаболизма характерен для нейронов поля СА1 гиппокампа, а самый высокий — для нейронов поля СА3. Обратимая глобальная ишемия приводила к повреждению нейронов пирамидного слоя гиппокампа, при этом количество неизмененных нейронов к концу 2-х суток реперфузионного периода существенно варьировало в зависимости от поля гиппокампа. Наибольшей чувствительностью к действию ишемии—реперфузии обладали нейроны полей СА1 и СА3. Пирамидные нейроны поля СА4 также демонстрировали довольно высокую чувствительность к ишемии, но их гибель была меньше, чем в полях СА1 и СА3. С другой стороны — практически все нейроны поля СА2 сохраняли жизнеспособность к концу 2-х суток реперфузионного периода. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, в которых было установлено, что наибольшей чувствительностью к действию обратимой ишемии—реперфузии обладают нейроны полей СА1 и СА3. В этих областях гиппокампа гибель нейронов наблюдалась при длительности ишемии от 5 мин [15, 21]. Также имеются ряд исследований, в которых показано, что нейроны поля СА1 являются более чувствительными к действию ишемии, чем нейроны поля СА3 [5, 20]. Можно предположить, что в разных полях гиппокампа неодинаковая устойчивость нейронов к ишемии обусловлена различными нейроно-глиальным индексом пирамидного слоя, степенью васкуляризации, а также разной интенсивностью функциональной нагрузки, приходящейся на то или иное поле гиппокампа. Нами установлено, что наибольшей чувствительностью к действию ишемии—реперфузии обладают нейроны с самой высокой и самой низкой активностью СДГ в группе ЛО-животных, а также, что ишемия с последующей реперфузией способствует увеличению активности СДГ в цитоплазме нейронов, сохранивших жизнеспособность, во всех полях гиппокампа. При этом максимальное увеличение активности наблюдается в цитоплазме нейронов полей СА1 и СА2, хотя они в данных полях обладают различной устойчивостью к действию ишемии—реперфузии. В исследовании, проведенном ранее на монгольских песчанках, было показано некоторое незначимое понижение активности СДГ в пирамидном слое гиппокампа поля СА1 после 5-минутной ишемии к концу 2-х суток ишемии [16]. В другом исследовании при изучении митохондрий нейронов и активности СДГ после травмы ГМ у крыс было обнаружено увеличение размеров митохондрий и активности СДГ через 24 ч после повреждения [8]. В нашем исследовании обнаружено повышение активности СДГ в нейронах пирамидного слоя во всех полях гиппокампа через 48 ч после моделирования обратимой глобальной ишемии ГМ, причем степень повышения активности существенно варьировала в зависимости от поля гиппокампа. Не исключено, что эффект активации СДГ нарастает параллельно со временем реперфузии, поскольку при исследовании активности 4 комплексов электрон-транспортной цепи несинаптических митохондрий, выделенных из нейронов гиппокампа крыс после 10-минутной глобальной ишемии к концу 1-х суток реперфузии, значимого изменения активности комплексов при сравнении с ЛО-животными обнаружено не было [11]. Известно, что транзиторная ишемия—реперфузия, не приводящая к гибели клетки, может играть адаптивную роль и приводить к повышению экспрессии ряда цитопротективных белков, включая белки теплового шока, циклооксигеназу-2, супероксиддисмутазу и др. Возникающее в результате этого через 24–48 ч повышение устойчивости клетки к последующей продолжительной ишемии—реперфузии получило название позднего прекондиционирования или «второго окна защиты» [7]. Хотя ферменты митохондрий, являющиеся компонентами дыхательной цепи, не относятся к классическим эффекторам позднего прекондиционирования, определенные предпосылки позволяют предполагать, что их экспрессия и/или активность могут возрастать в результате ишемического прекондиционирования. Так, например, на модели ишемии—реперфузии миокарда мыши было показано сохранение либо повышение активности NАDН-дегидрогеназы, СДГ и цитохром с-оксидазы после применения ишемического прекондиционирования [17]. Таким образом, повышение активности СДГ в цитоплазме нейронов, сохранивших жизнеспособность к моменту окончания реперфузии, может иметь компенсаторный характер. Применение ИПостК приводило к увеличению числа неизмененных нейронов в полях СА1 и СА3. В областях гиппокампа, наиболее чувствительных к выбранному режиму ишемии— реперфузии, использованный протокол ИПостК оказывал нейропротективное действие. Этот факт согласуется с результатами ряда исследований, в которых на различных экспериментальных моделях было показано, что применение ИПостК дает цитопротективный эффект в отдельных структурах ГМ [4, 29, 30]. При анализе активности СДГ в цитоплазме пирамидных нейронов гиппокампа было обнаружено, что активность СДГ при применении ИПостК понижалась по сравнению с активностью, наблюдаемой к концу реперфузии в неизмененных нейронах всех полей гиппокампа, а в полях СА3 и СА4 — не отличалась от таковой, регистрируемой в группе ЛО-животных. Следовательно, применение ИПостК способствовало уменьшению активации СДГ, вызванной ишемией—реперфузией. В ряде исследований с использованием различных экспериментальных моделей ишемии нервной ткани было показано, что ингибирование СДГ небольшими дозами 3-нитропропионовой кислоты приводило к формированию толерантности к последующей аноксии/ишемии [25, 26]. Это связано с наступлением умеренного клеточного энергодефицита в результате подавления окислительного фосфорилирования и переключения клетки на анаэробную продукцию АТФ, что подтверждается возрастанием содержания лактата в культуральной среде или плазме крови животного [13, 28]. В исследовании с использованием этой же экспериментальной модели было установлено, что применение аналогичного протокола ИПостК приводит к увеличению активности ЛДГ в цитоплазме нейронов поля СА1 гиппокампа [4]. Можно предположить, что выполнение дополнительных кратковременных эпизодов ишемии— реперфузии после завершения тестовой 7-минутной ишемии способствует многократному «переключению» клеток с аэробного на анаэробный путь образования энергии, что и запускает механизмы повышенной толерантности к реперфузионному повреждению. Основываясь на результатах настоящей работы, мы не можем ответить на вопрос, какие изменения активности СДГ и других митохондриальных ферментов предшествуют гибели нейронов в ходе реперфузионного периода. Однако, если принять, что степень активации СДГ в сохранивших жизнеспособность нейронах коррелирует с тяжестью ишемического—реперфузионного повреждения гиппокампа, можно сделать вывод, что ИПостК эффективно ослабляет выраженность данного феномена. Таким образом, полученные результаты подтверждают положение о том, что нейроны пирамидного слоя разных полей гиппокампа обладают неодинаковой устойчивостью к действию ишемии—реперфузии. Наиболее чувствительны к ишемии нейроны полей СА1 и СА3 гиппокампа. Обратимая ишемия способствует увеличению активности СДГ в неизмененных нейронах всех полей гиппокампа. Примененный протокол ИПостК приводил к уменьшению гибели нейронов полей СА1 и СА3 гиппокампа, а также вызывал снижение активации СДГ, индуцированной ишемией—реперфузией, в сохранивших жизнеспособность нейронах гиппокампа. Полученные результаты необходимо учитывать при разработке способов фармакологического посткондиционирования ГМ, а также рекомендаций по применению ИПостК в клинической практике.

Об авторах

Наталия Сергеевна Щербак

Институт сердечно-сосудистых заболеваний

Email: ShcherbakNS@yandex.ru
кафедра факультетской терапии

Михаил Михайлович Галагудза

Институт экспериментальной медицины, Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова

Email: galagoudza@mail.ru
197034, Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, 2

Галина Юрьевна Юкина

Научно-исследовательский центр

Email: pipson@inbox.ru

Евгений Робертович Баранцевич

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова

Email: professorerb@yandex.ru
кафедра неврологии и мануальной медицины 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6–8

Владимир Викторович Томсон

Научно-исследовательский центр

Email: nic.spb@mail.ru

Евгений Владимирович Шляхто

Институт экспериментальной медицины, Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова

Email: Shlyakhto@inbox.ru
197034, Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, 2

Список литературы

Дополнительные файлы