ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЯДЕРНОГО БЕЛКА NeuN/Fox-3 В КЛЕТКАХ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ



Цитировать

Полный текст

Аннотация

На срезах поджелудочной железы крыс в возрасте 1 мес и половозрелых (n=4) с использованием методов иммуноцитохимии и линии Вистар конфокальной лазерной микроскопии установлен ранее неизвестный факт присутствия белка NeuN в ненервных клетках - секреторных эпителиоцитах экзокринной части органа. Этот белок располагается в надъядерной части цитоплазмы несколько ниже зоны зимогенных гранул. До сих пор ядерный белок NeuN считался паннейрональным дифференцировочным маркером и использовался в исследованиях нейрогенеза.

Полный текст

Белок NeuN (Neuronal Nuclei) был открыт в 1992 г. [7] и считается конститутивным белком нуклеоплазмы нервных клеток [5]. Нуклеотидная последовательность NeuN была определена в 2009 г. и тогда же этот белок получил свое второе название - Fox-3 [6]. В настоящее время NeuN/Fox-3 считается паннейрональным дифференцировочным маркером и часто используется в исследованиях нейрогенеза [1]. Известны ряд исключений - NeuN/Fox-3 не встречается в отдельных популяциях нейронов (например, клетках Пуркинье мозжечка), а в нейронах черного вещества присутствует непостоянно [2]. Несмотря на значительную историю исследований, выполняемых с использованием антител к белку NeuN/ Fox-3, он никогда не был обнаружен в каких-либо иных клетках, кроме клеток нервной ткани. Цель настоящего исследования - продемонстрировать присутствие белка NeuN в секреторных эпителиоцитах экзокринной части поджелудочной железы крысы. Материал и методы. Работа проведена на крысах линии Вистар обоего пола в возрасте 1 мес и половозрелых (n=4). Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериентальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Поджелудочную железу фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде, обезвоживали, заливали в парафин и изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Leica, Германия). Перед проведением иммуногистохимической реакции на ядерный белок нервных клеток проводили тепловое демаскирование антигенов в растворе Target Retrieval Solution S1700 (Dako, Дания). Для выявления NeuN использовали мышиные моноклональные антитела (клон А60) (Merck-Millipore,США) в разведении 1:400, и набор EnVision+System Labeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001; Dako, Дания). Визуализацию прореагировавших антител проводили с применением диаминобензидина (DAB+, Dako, Дания). После постановки иммуногистохимической реакции часть гистологических препаратов докрашивали астровым синим, заключали в среду Cytoseal 60 (Richard-Allan, США) и анализировали с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия). Для конфокальной микроскопии после теплового демаскирования антигенов инкубацию в первичных антителах проводили в течении 18 ч при 27 °C. В качестве вторичных антител был использован реагент Link из набора LSAB+System-HRP (Dako, Дания). После инкубации с вторичными антителами препараты инкубировали в растворе стрептавидина, конъюгированного с индокарбоцианином (Сy3, Invitrogen, США) в разведении 1:70. Полученные препараты, заключенные в водорастворимую среду Fluorescence Mounting Medium (Dako, Дания), исследовали и фотографировали при помощи конфокального микроскопа LSM710 (Zeiss, Германия). Для анализа изображений использовали программу ZEN2012 (Zeiss, Германия). Результаты исследования. При постановке реакции на NeuN во всех изученных срезах поджелудочной железы у крысы была обнаружена положительная реакция в апикальной части цитоплазмы большинства экзокриноцитов концевых отделов. Различий, связанных с полом и возрастом животных, не наблюдали. В эндокриноцитах панкреатических островков реакция на NeuN отсутствовала. В нервных клетках интрамуральных ганглиев поджелудочной железы не имелось ни внутриядерной, ни цитоплазматической реакции на исследуемый нейрональный маркер. При конфокальной микроскопии (рисунок) в цитоплазме экзокринных панкреатоцитов обнаружено аналогичное скопление иммунопозитивного материала, располагающееся непосредственно под областью, занятой зимогенными гранулами, над ядром. Специфическая флюоресценция в ядрах клеток не определялась. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования было обнаружено, что белок NeuN/Fox-3, который постоянно присутствует в ядрах большинства нейронов ЦНС [7], локализован в одном из цитоплазматических компартментов экзокриноцитов поджелудочной железы крысы. Это - первое обнаружение NeuN вне клеток нервной системы. Учитывая высокую специфичность использованных антител (а это - именно тот клон антител, который был получен первооткрывателями данного белка [7]) и воспроизводимость результатов в случае применения как пероксидазной, так и флюоресцентной метки, можно заключить, что результат реакции не является артефактом. Несмотря на значительное число иммуноцитохимических исследований поджелудочной железы, в том числе и выполняемых в Институте экспериментальной медицины [3], этот орган не изучали с использованием антител к NeuN. Поэтому установленный в настоящей работе факт ранее не был известен. Субклеточная структура, в которой концентрируется изучаемый белок, при использованной методике исследования не может быть идентифицирована. В соответствии с областью локализации - надъядерная часть цитоплазмы несколько ниже зоны зимогенных гранул - ею может оказаться и гранулярная эндоплазматическая сеть, и комплекс Гольджи. Последнее предположение менее вероятно в связи с данными о связи NeuN в нейронах c РНК [4]. Отсутствие белка NeuN в нейронах интрамуральных ганглиев поджелудочной железы у крысы не имеет удовлетворительного объяснения. Известно, что для отдельных нейрональных популяций не характерно присутствие данного белка [7], что рассматривается как исключение из общего правила. Таким образом, впервые получены данные об экспрессии нейронального белка NeuN в секреторных клетках поджелудочной железы. Вопрос о причинах присутствия этого нейронального белка в ненервных клетках остается открытым и нуждается в дальнейшем изучении.
×

Об авторах

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: dek2@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии; кафедра фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Глеб Владимирович Безнин

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Елена Андреевна Колос

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Ольга Викторовна Кирик

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

Email: iemmorphol@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Список литературы

  1. Коржевский Д. Э., Петрова Е. С., Кирик О. В. и др. Нейральные маркеры, используемые при изучении дифференцировки стволовых клеток // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. Т. 5, вып. 3. С. 57-63.
  2. Сухорукова Е. Г. Ядерный белок NeuN в нейронах черного вещества головного мозга человека // Морфология. 2013. Т. 143, вып. 2. С. 78-80.
  3. Чумасов Е. И., Петрова Е. С., Коржевский Д. Э. Распределение и структурная организация автономных нервных аппаратов в поджелудочной железе крысы (иммуногистохимическое исследование) // Морфология. 2011. Т. 139, вып. 3. С. 51-58.
  4. Darnell R. B. RNA Protein Interaction in Neurons // Annu. Rev. Neurosci. 2013. Vol. 36. P. 243-270.
  5. Dent M. A., Segura-Anaya E., Alva-Medina J., Aranda-Anzaldo A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix // FEBS Lett. 2010. Vol. 584, № 13. P. 2767-2771.
  6. Kim K. K., Adelstein R. S., Kawamoto S. Identification of neuronal nuclei (NeuN) as Fox-3, a new member of the Fox-1 gene family of splicing factors // J. Biol Chem. 2009. Vol. 284. P. 31052-31061.
  7. Mullen R. J., Buck C. R., Smith A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates // Development. 1992. Vol. 116. P. 201-211.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 2015


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.