CYTOPLASMIC LOCALIZATION OF NEUN/Fox-3 NUCLEAR PROTEIN IN THE PANCREATIC CELLS



如何引用文章

全文:

详细

The study of the sections of Wistar rat pancreas (n=4) using the methods of immunocytochemistry and confocal laser microscopy has demonstrated previously unknown fact of the presence of NeuN protein in the secretory epithelial cells of the exocrine part of this organ. The protein was located in the apical part of the cytoplasm slightly below the zone of zymogen granules. Until now the nuclear protein NeuN was considered to be the panneuronal differentiation marker and was used in the studies of neurogenesis.

全文:

Белок NeuN (Neuronal Nuclei) был открыт в 1992 г. [7] и считается конститутивным белком нуклеоплазмы нервных клеток [5]. Нуклеотидная последовательность NeuN была определена в 2009 г. и тогда же этот белок получил свое второе название - Fox-3 [6]. В настоящее время NeuN/Fox-3 считается паннейрональным дифференцировочным маркером и часто используется в исследованиях нейрогенеза [1]. Известны ряд исключений - NeuN/Fox-3 не встречается в отдельных популяциях нейронов (например, клетках Пуркинье мозжечка), а в нейронах черного вещества присутствует непостоянно [2]. Несмотря на значительную историю исследований, выполняемых с использованием антител к белку NeuN/ Fox-3, он никогда не был обнаружен в каких-либо иных клетках, кроме клеток нервной ткани. Цель настоящего исследования - продемонстрировать присутствие белка NeuN в секреторных эпителиоцитах экзокринной части поджелудочной железы крысы. Материал и методы. Работа проведена на крысах линии Вистар обоего пола в возрасте 1 мес и половозрелых (n=4). Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериентальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Поджелудочную железу фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде, обезвоживали, заливали в парафин и изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Leica, Германия). Перед проведением иммуногистохимической реакции на ядерный белок нервных клеток проводили тепловое демаскирование антигенов в растворе Target Retrieval Solution S1700 (Dako, Дания). Для выявления NeuN использовали мышиные моноклональные антитела (клон А60) (Merck-Millipore,США) в разведении 1:400, и набор EnVision+System Labeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001; Dako, Дания). Визуализацию прореагировавших антител проводили с применением диаминобензидина (DAB+, Dako, Дания). После постановки иммуногистохимической реакции часть гистологических препаратов докрашивали астровым синим, заключали в среду Cytoseal 60 (Richard-Allan, США) и анализировали с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия). Для конфокальной микроскопии после теплового демаскирования антигенов инкубацию в первичных антителах проводили в течении 18 ч при 27 °C. В качестве вторичных антител был использован реагент Link из набора LSAB+System-HRP (Dako, Дания). После инкубации с вторичными антителами препараты инкубировали в растворе стрептавидина, конъюгированного с индокарбоцианином (Сy3, Invitrogen, США) в разведении 1:70. Полученные препараты, заключенные в водорастворимую среду Fluorescence Mounting Medium (Dako, Дания), исследовали и фотографировали при помощи конфокального микроскопа LSM710 (Zeiss, Германия). Для анализа изображений использовали программу ZEN2012 (Zeiss, Германия). Результаты исследования. При постановке реакции на NeuN во всех изученных срезах поджелудочной железы у крысы была обнаружена положительная реакция в апикальной части цитоплазмы большинства экзокриноцитов концевых отделов. Различий, связанных с полом и возрастом животных, не наблюдали. В эндокриноцитах панкреатических островков реакция на NeuN отсутствовала. В нервных клетках интрамуральных ганглиев поджелудочной железы не имелось ни внутриядерной, ни цитоплазматической реакции на исследуемый нейрональный маркер. При конфокальной микроскопии (рисунок) в цитоплазме экзокринных панкреатоцитов обнаружено аналогичное скопление иммунопозитивного материала, располагающееся непосредственно под областью, занятой зимогенными гранулами, над ядром. Специфическая флюоресценция в ядрах клеток не определялась. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования было обнаружено, что белок NeuN/Fox-3, который постоянно присутствует в ядрах большинства нейронов ЦНС [7], локализован в одном из цитоплазматических компартментов экзокриноцитов поджелудочной железы крысы. Это - первое обнаружение NeuN вне клеток нервной системы. Учитывая высокую специфичность использованных антител (а это - именно тот клон антител, который был получен первооткрывателями данного белка [7]) и воспроизводимость результатов в случае применения как пероксидазной, так и флюоресцентной метки, можно заключить, что результат реакции не является артефактом. Несмотря на значительное число иммуноцитохимических исследований поджелудочной железы, в том числе и выполняемых в Институте экспериментальной медицины [3], этот орган не изучали с использованием антител к NeuN. Поэтому установленный в настоящей работе факт ранее не был известен. Субклеточная структура, в которой концентрируется изучаемый белок, при использованной методике исследования не может быть идентифицирована. В соответствии с областью локализации - надъядерная часть цитоплазмы несколько ниже зоны зимогенных гранул - ею может оказаться и гранулярная эндоплазматическая сеть, и комплекс Гольджи. Последнее предположение менее вероятно в связи с данными о связи NeuN в нейронах c РНК [4]. Отсутствие белка NeuN в нейронах интрамуральных ганглиев поджелудочной железы у крысы не имеет удовлетворительного объяснения. Известно, что для отдельных нейрональных популяций не характерно присутствие данного белка [7], что рассматривается как исключение из общего правила. Таким образом, впервые получены данные об экспрессии нейронального белка NeuN в секреторных клетках поджелудочной железы. Вопрос о причинах присутствия этого нейронального белка в ненервных клетках остается открытым и нуждается в дальнейшем изучении.
×

作者简介

D. Korzhevskiy

RAS Research Institute of Experimental Medicine; St.Petersburg State University

Email: dek2@yandex.ru
Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical Technology

G. Beznin

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

Ye. Kolos

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

O. Kirik

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

参考

  1. Коржевский Д. Э., Петрова Е. С., Кирик О. В. и др. Нейральные маркеры, используемые при изучении дифференцировки стволовых клеток // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. Т. 5, вып. 3. С. 57-63.
  2. Сухорукова Е. Г. Ядерный белок NeuN в нейронах черного вещества головного мозга человека // Морфология. 2013. Т. 143, вып. 2. С. 78-80.
  3. Чумасов Е. И., Петрова Е. С., Коржевский Д. Э. Распределение и структурная организация автономных нервных аппаратов в поджелудочной железе крысы (иммуногистохимическое исследование) // Морфология. 2011. Т. 139, вып. 3. С. 51-58.
  4. Darnell R. B. RNA Protein Interaction in Neurons // Annu. Rev. Neurosci. 2013. Vol. 36. P. 243-270.
  5. Dent M. A., Segura-Anaya E., Alva-Medina J., Aranda-Anzaldo A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix // FEBS Lett. 2010. Vol. 584, № 13. P. 2767-2771.
  6. Kim K. K., Adelstein R. S., Kawamoto S. Identification of neuronal nuclei (NeuN) as Fox-3, a new member of the Fox-1 gene family of splicing factors // J. Biol Chem. 2009. Vol. 284. P. 31052-31061.
  7. Mullen R. J., Buck C. R., Smith A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates // Development. 1992. Vol. 116. P. 201-211.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载

版权所有 © Eco-Vector, 2015


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.