Влияние водорастворимой формы дигидрокверцетина на зависимое от возраста ЛПС-индуцированное глиоваскулярное ремоделирование черной субстанции мозга крыс

Полный текст

Обоснование

Старение является важнейшим фактором риска целого ряда нейродегенеративных заболеваний [1], в том числе, болезни Паркинсона (БП) [2], которая вызывается гибелью дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции (ЧС) [3]. Развитию нейродегенеративного процесса предшествует хроническое нейровоспаление, для которого характерны микро- и астроглиоз [4, 5], синтез глиальными клетками провоспалительных цитокинов [6], повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [7] и патологический ангиогенез [8], который по мере развития заболевания сменяется сосудистой регрессией [9].

Ранее полученные доказательства того, что экспериментально вызванное нейровоспаление у старых животных оказывает более выраженное повреждающее воздействие на нейроны черной субстанции по сравнению с молодыми [10, 11], позволяет полагать, что патогенез БП может быть обусловлен сочетанием процессов, которые развиваются в черной субстанции в ходе старения, и действием дополнительных эндо- и/или экзогенных провоспалительных факторов [12, 13].

Поскольку нейровоспаление является ключевым патофизиологическим механизмом нейродегенеративных заболеваний [14, 15], ранее предпринимались попытки применения противовоспалительной терапии для предотвращения их прогрессирования. Однако выяснилось, что традиционные средства, такие как нестероидные противовоспалительные препараты, могут оказывать как защитное, так и повреждающее действие [16]. Поиск новых препаратов для ингибирования нейровоспалительных процессов остаётся актуальной проблемой неврологии.

В последние годы все больше внимание исследователей привлекает возможность использования в качестве антиоксидантных и противовоспалительных средств флавоноидов - полифенольных вторичных метаболитов растений [17, 18]. В частности, дигидрокверцетин рассматривается качестве потенциального терапевтического средства для облегчения тяжести нейродегенеративных заболеваний [19]. Еще более выраженный цитопротективный эффект в условиях in vitro продемонстрировала инновационная водорастворимая форма дигидрокверцетина (ДГК-ВФ) [20].

Остается до конца невыясненным вопрос о репертуаре клеток - мишеней в ЦНС и молекулярных механизмах, которые могли бы опосредовать потенциальное противовоспалительное действие ДГК-ВФ. В настоящее время сформировано мнение о том, что на действие эндогенных и экзогенных стимулов в головном мозгу реагируют не отдельные клетки, а региональные клеточные микросистемы, обозначаемые в литературе как нейроваскулярные единицы (НВЕ) [21, 22]. Предполагается, что паракринные и контактные взаимодействия между эндотелиоцитами, перицитами, периваскулярными макрофагами, астроцитами, микроглиоцитами и нейронами, образующими НВЕ, лежат в основе системных реакций, обеспечивающих локальный тканевой гомеостаз в условиях физиологической нормы, а их нарушения, наблюдаемые с возрастом, могут лежать в основе нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний [23, 24]. Однако до последнего времени не проводилось комплексных исследований, учитывающих интегральный характер возрастзависимых реакций компонентов нейроваскулярных единиц на предполагаемое протективное действие ДГК-ВФ в модели ЛПС-индуцированного нейровоспаления.

Цель

Исследовать структурные перестройки микроциркуляторного русла и реакции микро- и астроглиоцитов в черной субстанции мозга молодых и старых крыс в ответ на стереотаксическое введение в неё липополисахарида (ЛПС) и последующий пероральный прием ДГК-ВФ.

Материалы и Методы

Исследование выполнено на 18 молодых (возраст 3 месяца, вес 250-300 г.) и 18 старых (возраст 18 месяцев, вес 390-450 г.) самцах крыс линии Вистар, содержащихся в стандартных условиях (12-часовой световой день, свободный доступ к пище и воде) в  соответствии  с  Европейской  конвенцией  о  защите  позвоночных  животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 2006) и с разрешения Этического комитета Ижевской государственной медицинской академии (№ 658 от 23.04.2018 г.). 

Молодым и старым животным экспериментальных групп (в каждой по 12 крыс) вводили в область черной субстанции мозга унилатерально, при помощи стереотаксической установки 2 мкл раствора липополисахарида (Sigma-Aldrich, USA) в концентрации 0,01 мкл/мл по следующим координатам: 5,2 мм каудальнее брегмы, 2.0 мм латеральнее осевого шва на глубину 7.2 мм относительно твердой мозговой оболочки. Крысам контрольных групп (по 6 молодых и старых животных в каждой) аналогичным образом вводили 2 мкл стерильного физиологического раствора. Половине животных экспериментальных групп (по 6 животных разного возраста) ежедневно перорально при помощи зонда вводили 2 мл раствора, содержащего ДГК-ВФ в концентрации 3 мг/мл. В качестве источника ДГК-ВФ использовали биологически активная добавка к пище "Таксифолин аква" (свидетельство о государственной регистрации № RU.77.99.11.003. E.003036.07.18, ООО "Продвинутые технологии", РФ). Оставшаяся половина животных получала аналогичным способом 2 мл стерильного физиологического раствора. 

Через 8 недель после унилатерального введения в черную субстанцию физиологического раствора (контроль) или ЛПС (основная группа) растворов животным контрольных и основных групп проводили транскардиальную перфузию 4%-м параформальдегидом, извлекали мозг для гистохимического и иммуногистохимического окрашивания и выдерживали его в 20%-м растворе сахарозы. Криостатные срезы толщиной 14 мкм окрашивали лектином томата, коньюгированного с ФИТЦ (1:100, Chamicon, CA) для гистохимического окрашивания эндотелиальной выстилки сосудов. Для иммуногистохимического выявления микро- и астроглии использовали, соответственно, антитела к CD-11β (1:500, Sigma-Aldrich, USA) и GFAP (1:500, Sigma-Aldrich, USA).

Оцифрованные изображения препаратов получали при помощи люминесцентного микроскопа Nikon Eclipse E200 (Nikon Instruments Inc., Japan), совмещенного с цифровым фотоаппаратом MicroPublisher 3.3 RTV (QImaging, Canada). Измерение площадей иммунопозитивных структур (клеточных тел и их отростков) осуществляли при помощи морфометрической программы ImagePro Inside 8.0 (Media Cybernetics, USA) на 8 стандартных прямоугольных площадках 620x480 мкм в области черной субстанции, получаемых с каждого животного. Для подсчета количества сосудов и их бифуркаций, а также измерения их длины использовали компьютерную программу AngioTool [25].  Для статистического анализа отбирали посредством сегментации изображения сосуды с малым диаметром от 4 до 12 мкм, что соответствует размерному диапазону капилляров и венул микроциркуляторного русла. Результаты представляли в процентах от уровня молодых контрольных животных, среднее арифметическое которых принимали за 100%. 

Статистический анализ проводили в компьютерной программе «Statistica 10.0». Проверку данных на нормальность распределения выполняли с помощью теста Шапиро - Уилка. Множественное сравнение между исследованными группами проводили при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с постериорным анализом Тьюка. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости P <0,05.

 

Результаты

Сравнительный анализ морфологии микрососудов, меченых лектином томата (рис.1) и интенсивности иммунопозитивного мечения глиальных клеток в области черной субстанции крыс в норме и в экспериментальных условиях показал значительные различия между животными разного возраста. Так, средняя длина сосудов у контрольных старых животных, подсчитанных на стандартной площадке, превышала этот показатель у молодых особей контрольной группы на 76,5% (P=0,00005), но количество микрососудов при этом было достоверно меньшим на 24,1% (P=0,041) (рис. 2а, б). Тенденция к более низкому количеству бифуркаций у старых животных не достигала достоверного уровня.

Рис.1. Сравнительная морфология сосудов черной субстанции молодых и старых крыс, меченных лектином томата, коньюгированного с ФИТЦ, через 8 недель после введения в нее физиологического раствора (контроль), липополисахарида (ЛПС) и липополисахарида с одновременным пероральным введением водорастворимой формы дегидрокварцетина (ЛПС+ДГК-ВФ). Увеличение: Ок.40. Длина линии = 120 мкм.

Через 8 недель после однократного введения ЛПС в область ЧС молодым крысам в ней обнаруживалась незначительная тенденция к увеличению средней длины сосудов, количеству сосудов и их бифуркаций относительно соответствующего контроля. В тоже время, старые животные в этих условиях демонстрировали значительные изменения в организации сосудистого русла. У них обнаружено достоверное снижение на 33,6% средней длины сосудов (P=0,038), на фоне значительного роста количества сосудов на 69,2% (P=0,00018), и на 57,4% (P=0,00019) количества их бифуркаций относительно контрольных животных того же возраста. 

Рис.2 Средняя длина сосудов (А), количество сосудов (Б) и бифуркаций сосудов (В), подсчитанных на стандартных площадках в области ЧС у молодых и старых животных контрольной и экспериментальных групп в процентах относительно молодых контрольных животных, показатели которых принимались за 100%.  * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.

Сравнение морфометрических показателей микроциркуляторного русла у старых крыс, продемонстрировавших достоверные изменения после введения ЛПС в ЧС и получавших перорально ежедневную дозу ДКГ-ВФ на протяжении 8 недель, свидетельствовало о нормализующем эффекте препарата. Количество микрососудов в паренхиме старых животных после сочетания интранигрального введения ЛПС и приемов ДКГ-ВФ было ниже на 48% (Р=0,0068), чем у ЛПС-обработанных крыс, получавших перорально физиологический раствор. Кроме того, у этих животных была отмечена тенденция к снижению количества бифуркаций сосудов по сравнению с ЛПС-обработанными крысами соответствующего возраста, однако она не достигала уровня статистической значимости.

Площадь иммунореактивных к GFAP структур, соответствующих клеточным телам и отросткам астроглиоцитов (рис. 3), у контрольных старых крыс достоверно превышала этот показатель у молодых контрольных животных на 37,4% (P=0,025).

Рис.3. А. Экспрессия иммунореактивных к GFAP клеточных тел и отростков в области черной субстанции молодых и старых животных через 8 недель после введения в нее физиологического раствора (контроль), липополисахарида (ЛПС) и липополисахарида с пероральным введением дегидрокварцетина (ЛПС+ ДГК-ВФ). Увеличение: Ок.40. Длина линии = 80 мкм. Б. Площадь иммунореактивных к GFAP структур, подсчитанная на стандартных площадках животных контрольной и экспериментальных групп   в процентах относительно молодых контрольных животных, показатели которых принимались за 100%; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.

У молодых и старых животных с введенным ЛПС в область ЧС отмечалось достоверное увеличение относительно контроля соответствующего возраста площадей клеточных тел и отростков, иммунопозитивных к GFAP на 48% (P=0,012) и 87,8% (P=0,00033), соответственно. Превышение площадей, занимаемых иммунопозитивными структурами у старых животных по сравнению с молодыми при этом составило 80,5% (Р=0,0029). Пероральное введение ДГК-ВФ старым животным с интранигральным введением ЛПС достоверно снижало на 58,9% (Р=0,0068) площадь иммунопозитивных к GFAP структур по сравнению с животными, не принимавшими ДГК-ВФ; у молодых животных снижение этого показателя после приема ДГК-ВФ на 18,3% не было достоверным.

Площадь, занимаемых иммунореактивными к CD-11β клеточными телами и отростками у старых контрольных животных достоверно превышала таковую у молодых на 40,1% (P= 0,012). Введение ЛПС в ЧС приводило к достоверному превышению относительно контроля соответствующего возраста площади иммунопозитивно окрашенной микроглии в обеих возрастных группах: у молодых на 64,7% (P= 0,00047) и на 111,8 % (P = 0,00051) у старых (рис.4). Превышение экспрессии CD-11β у старых животных над молодыми составило 87,2% (Р= 0,0029).

Рис.4. А. Экспрессия иммунореактивных к CD-11β клеточных тел и отростков в области черной субстанции молодых и старых животных через 8 недель после введения в нее физиологического раствора (контроль), липополисахарида (ЛПС) и липополисахарида с пероральным введением водной формы дегидрокварцетина (ЛПС+ ДГК-ВФ). Увеличение: Ок.40. Длина линии = 30 мкм. Б. Площадь иммунореактивных к CD-11β структур, подсчитанная на стандартных площадках животных контрольной и экспериментальных групп   в процентах относительно молодых контрольных животных, показатели которых принимались за 100%; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.

Пероральное введение ДГК-ВФ крысам с введенным в ЧС ЛПС достоверно снижало стимулирующее действие эндотоксина на микроглию как у молодых (на 48,5%; Р= 0,0042), так и старых животных (на 77,3%; Р= 0,0083).

Обсуждение

Анализ морфологии микроциркуляторного русла и экспрессии иммунопозитивных маркеров глиальных клеток в ЧС у животных разного возраста продемонстрировал наличие 

значительных возрастзависимых отличий между ними как в контроле, так и после однократного введения ЛПС, который, как известно, способен индуцировать нейровоспаление [26, 27]. Важно отметить, что у старых крыс, даже в условиях физиологической нормы, в области ЧС мы наблюдали признаки нейровоспалительного процесса: повышенную глиальную активность, о чем свидетельствовало достоверное превышение площадей, занимаемых клеточными телами и отростками микро- и астроглии, а также увеличенную извилистость сосудов на фоне их сниженной плотности относительно молодых животных. Подобное низкоуровневое нейровоспаление, вызываемое старением, получило в англоязычной литературе обозначение «neuroinflammaging» [28].

Введение ЛПС в ЧС крыс вызывало значительно более выраженные глиоваскулярные перестройки у старых животных по сравнению с молодыми. Вероятно, наличие нейровоспаления низкой интенсивности у старых животных в контроле облегчает клеточную активацию в ответ на   воздействие дополнительного провоспалительного фактора. Ранее мы показали, что у контрольных молодых животных, в отличие от старых, в глиальных клетках ЧС выше синтез трофических факторов, но ниже активность ферментов, синтезирующих активные формы кислорода [11], что может ограничивать интенсивность их реагирования на введение ЛПС. Известно, что микроглия играет ключевую роль в опосредовании действия ЛПС на микроциркуляторное русло [29]. Исходя из полученных нами результатов, логично полагать, что ремоделирование микрососудистого русла может быть индуцировано в условиях высокого уровня провоспалительной глиальной активации, которая наиболее выражена у старых животных. Введение ЛПС в область ЧС не только повышало извилистость сосудов малого диаметра, но и индуцировало ангиогенез, о чём свидетельствовало увеличение количества микрососудов и их бифуркаций. Последнее, согласно данным литературы, свойственно для интуссусцептивного (расщепляющего) ангиогенеза - образования нового кровеносного сосуда путем разделения, существующего на две части [30]. Наше предположение о ЛПС-индуцированном ангиогенезе в ЧС старых крыс согласуется с данными о том, что во взрослом мозге он обычно вызывается гипоксией или воспалением [31].

Принято считать, что эндотелиальные клетки и перициты микрососудов, нервные, микро- и астроглиальные и клетки на основе паракринных и контактных взаимодействий образуют НВЕ - региональные микросистемы мозга, которые не только поддерживают локальный гомеостаз, но, при определенных условиях, могут формировать самоподдерживающийся патофизиологический цикл нейровоспаления [23]. Исследованные в нашем эксперименте элементы НВЕ проявили различную степень реактивности на введение ЛПС: наиболее выраженные изменения как у молодых, так и старых животных относительно возрастного контроля продемонстрировала микро- и астроглия, тогда как значительная перестройка микрососудистого русла была обнаружена лишь у старых животных. Вероятной причиной такой возрастзависимой особенности может быть качественное различие морфофункциональных типов в составе ЛПС- активированной глии у крыс разного возраста. Известно, что как микроглия, так и астроглия, в зависимости от интенсивности провоцирующего фактора, могут дифференцироваться либо в нейропротективные (соответственно, М2 и А2), либо в нейротоксичные (М1 и А1) морфофункциональные клеточные типы [32, 33, 34, 35].

Можно предположить, что хроническая активация глиоцитов у старых животных в ответ на введение ЛПС характеризуется не только большей интенсивностью, но и образованием преимущественно нейротоксических М1 и А2 цитофенотипов, которые, продуцируют провоспалительные факторы и цитокины. Например, в патологических условиях активированная астроглия повышает синтез васкулярного эндотелиального ростового фактора-A, который индуцирует ангиогенез, нарушает целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и усиливает нейровоспаление [36]. Высказанное предположение о ключевой роли провоспалительной поляризации микро- и астроглии в механизмах ремоделирования обменного русла у старых животных требует дальнейшей экспериментальной проверки и выяснения возможных молекулярных механизмов такой связи.

Ежедневный прием ДГК-ВФ на протяжении 8 недель приводил к значительному снижению признаков ЛПС-индуцированного нейровоспаления у испытуемых животных, причем, у старых животных снижение было более выраженным, чем у молодых. Несмотря на то, что полифенольные соединения начали рассматриваться в качестве потенциальных нейропротективных средств достаточно давно [37, 38], возможность и предполагаемые пути проникновения полифенолов через ГЭБ в условиях in vivo остаются предметом дискуссий [39, 40, 41]. Однако, ранее опубликованные данные о способности дигидрокверцетина ингибировать активность ферментов нервной ткани мозга крыс, участвующих в синтезе провоспалительных активных форм кислорода и азота (соответственно, циклооксигеназы-2, локализующейся в эндотелии, и глиальной индуцибельной нитроксидсинтазы) [42], позволяют сделать предположение о том, что наблюдаемые эффекты могут быть следствием прямого воздействия циркулирующего полифенола (или его метаболитов) не только на эндотелий микрососудов, но и на микро- и астроглиальные клетки после его прохождения через ГЭБ.

Заключение

Через 8 недель после введения ЛПС в ЧС старым крысам обнаружено достоверное превышение площадей, занимаемых клеточными телами и отростками микроглиальных и астроглиальных клеток, а также количества сосудов на стандартных площадках по сравнению как с молодыми животными, испытавшими аналогичное воздействие, так и с контрольными старыми животными.  Пероральное введение крысам ДГК-ВФ достоверно снижало ЛПС- индуцированную глиальную активацию у молодых и старых животных. Кроме того, прием старыми животными ДГК-ВФ снижал интенсивность ремоделирования микрососудистого русла ЧС, вызываемый введением ЛПС. Описанные эффекты ДГК-ВФ позволяют рассматривать его в качестве перспективного средства, ингибирующего нейровоспаление, которое может быть использовано для снижения скорости прогрессирования болезни Паркинсона.

 

 

Об авторах

Валерий Георгиевич Сергеев

ФГБОУ ВО "Удмуртский государственный университет";
ФГБОУ ВО "Ижевская государственная медицинская академия"

Автор, ответственный за переписку.
Email: cellbio@ya.ru
ORCID iD: 0000-0002-5211-1832
SPIN-код: 1476-3236

доктор биологических наук, заведующий кафедрой физиологии, клеточной биологии и биотехнологии

Россия, 426034 г. Ижевск, ул. Университетская 1; 426056 г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281

Елена Сергеевна Алалыкина

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

Email: alena-immun@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0006-3510-0337
SPIN-код: 5364-8013

аспирант

Россия, 426034 г. Ижевск, ул. Университетская 1

Татьяна Николаевна Сергеева

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

Email: tnbio@ya.ru
ORCID iD: 0000-0001-8273-8348
SPIN-код: 9300-2217

старший преподаватель кафедры

Россия, 426034 г. Ижевск, ул. Университетская 1

Михаил Арсенович Ананян

OOO "Продвинутые технологии"

Email: nanoindustry@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-9019-6981
SPIN-код: 5172-9152

Доктор технических наук, генеральный директор ООО

Россия, 119334, г. Москва, ул. Бардина, 4 корп. 1

Виктор Михайлович Чучков

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

Email: vmchuchkov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9959-689X
SPIN-код: 2347-2890

доктор медицинских наук,

профессор кафедры физиологии, клеточной биологии и биотехнологии 

Россия, 426034 г. Ижевск, ул. Университетская 1

Список литературы

Дополнительные файлы