Нервные структуры органов средостения новорождённой крысы

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

В ранее выполненных исследованиях в околосердечной области с помощью нейрогистологических, гистохимических методов и электронной микроскопии описано большое многообразие нервных структур: ганглиев, параганглиев, нервных сплетений, миелинизированных и немиелинизированных нервных проводников [1–4]. Показано, что в иннервации тканей и органов дорсального и среднего отделов средостения (СРДС) животных и человека принимают участие нервные волокна из различных отделов периферической нервной системы, в том числе симпатического и парасимпатических звеньев автономной нервной системы [5]. В последние десятилетия, кроме классических светооптических нейрогистологических методов и электронной микроскопии, широко используются иммуногистохимические (ИГХ) методы. Они позволяют селективно выявлять нервные аппараты различной медиаторной природы разных отделов сердечно-сосудистой, дыхательной и пищеварительной систем как в норме, так и при патологических состояниях [6–9]. Наибольшее внимание исследователи уделяют иннервации сердца и магистральных кровеносных сосудов человека и экспериментальных животных [6, 7, 10, 11], менее изученной остаётся иннервация других жизненно важных анатомических образований, локализованных в СРДС: бронхов, пищевода, лёгочных и полых вен, жировой ткани. Мало изучены вопросы, связанные с развитием иннервации СРДС у новорождённых, когда происходит переключение процесса кровообращения с плацентарного на лёгочное, а также в первые сутки постнатального развития, когда наблюдается становление регуляции дыхания и функционирования органов сердечно-сосудистой системы. В предыдущих исследованиях на крысах с применением ИГХ-маркёров, позволяющих проводить комплексное исследование нейронов, нервных сплетений, нервных волокон и терминалей парасимпатической и симпатической нервной системы (белок PGP 9.5, тирозингидроксилаза, синаптофизин), мы уделяли внимание главным образом сердцу [9, 11].

Цель настоящей работы — сравнительное иммуногистохимическое исследование особенностей иннервации органов средостения новорождённой крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведено экспериментальное одноцентровое одномоментное выборочное неконтролируемое исследование.

Критерии включения: крысы линии Вистар в возрасте 1 сут после рождения.

Объектами исследования служили органы и ткани средостения крыс линии Вистар в возрасте 1 сут (Р1) (n=10). При работе с животными соблюдали международные правила Европейского сообщества по гуманному обращению с экспериментальными животными. Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/22 от 06.04.2022).

Материал фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида в течение одних суток [12] и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле заливали в парафин. Парафиновые фронтальные срезы через сердечно-лёгочный комплекс толщиной 5–7 мкм изготавливали на ротационном микротоме Pfm Rotary 3003 (PFM medical, Германия). На срезах после депарафинирования проводили иммуногистохимические реакции на тирозингидроксилазу, белок PGP 9.5, синаптофизин. Тирозингидроксилазу — ферментный маркёр катехоламинергических структур — выявляли с помощью кроличьих поликлональных антител (Abcam, Великобритания); для выявления белка PGP 9.5 использовали поликлональные кроличьи антитела (Spring Bioscience, США); для синаптофизина — поликлональные кроличьи антитела (MONOSAN, Нидерланды). Первичные антитела наносили на гистологические срезы на 24 ч. В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Fisher Scientific, США). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим, гематоксилином и эозином, а также астровым синим. Анализ гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica Microsystems, Германия) и цифровой камеры Leica ICC50 (Leica Microsystems, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Прежде чем переходить к морфологическому анализу материала, необходимо отметить ряд топографических особенностей, отражающих общую макроскопическую картину СРДС у новорождённых крыс. В пределах гистологического препарата, окрашенного гематоксилином и эозином или толуидиновым синим, при малом увеличении микроскопа (×40) на продольных срезах можно видеть большинство органов средостения (mediastinum), включая сердце. На срезах отчётливо определяются стволы блуждающего и возвратного нервов, главные бронхи, магистральные венозные и артериальные сосуды, фрагменты пищевода, лимфатических узлов, ганглиев. Пространства между органами заполнены фасцикулярно-клеточными элементами рыхлой соединительной ткани, формирующимися дольками жировой ткани и сосудами микроциркуляторного русла (рис. 1).

 

Рис. 1. Органы средостения новорождённой крысы: Б — бронхи, П — пищевод, М — миокард предсердия, С — створки сердечного клапана, Ла — легочная артерия, Лу — лимфатический узел, Ж — жировая ткань, В — вены, Н — нервные стволы, Г — атриальный ганглий. Иммуногистохимическая реакция на PGP 9.5 (а), на тирозингидроксилазу (b); подкраска гематоксилином (а), толуидиновым синим (b); ×40.

 

Иммуногистохимический анализ позволил установить важные особенности и закономерности иннервации органов и тканей СРДС. В разных участках фасцикулярной соединительной ткани встречаются ганглии, нервные стволики и пучки нервных волокон, образующие различной плотности сплетения. С помощью ИГХ-реакции на белок PGP 9.5 и тирозингидроксилазу выяснилось, что они имеют различный биохимический статус, холинергическую и/или симпатическую природу (см. рис. 1). Следует отметить, что в области средостения новорождённых крыс встречаются нервные аппараты с морфологическими признаками зрелости, а также незрелые структуры, находящиеся в состоянии роста и развития. Иннервация стенки пищевода, синусно-предсердного узла сердца и ганглия бронхиального сплетения достаточно дифференцирована. На этой стадии развития практически во всех ганглиях наблюдаются нейробласты и молодые нейроны небольших размеров, с узким ободком цитоплазмы, неразвитой хроматофильной субстанцией. В таких ганглиях вокруг нейронов ещё нет зрелых перицеллюлярных синаптических сплетений, но уже имеются отдельные скопления пресинаптических бутонов межнейронных синапсов.

В нервных сплетениях СРДС наряду с крупными ганглиями встречаются микроганглии, островки и группы хромаффинных клеток. Между главными бронхами и лёгочными венами постоянно выявляется несколько крупных ганглиев, достигающих в длину от 150 до 300 мкм. На рис. 2 представлен один из сердечных нервных узлов, тесно прилежащий к задней стенке миокарда между правым и левым предсердиями. Выше над ним видны два главных бронха и профили вен (см. рис. 1).

 

Рис. 2. Нервные структуры в средостении новорождённой крысы: ↑↑ — дифференцирующися синапсы преганглионарные волокна на TH–/PGP 9.5+ нейронах сердечного парасимпатического ганглия (Г); * TH-иммунонегативные нейроны в симпатическом нервном стволе. Иммуногистохимические реакции на белок PGP 9.5 (а, d), синаптофизин (b) и тирозингидроксилазу (c); ×400. TH — tyrosine hydroxylase (тирозингидроксилаза).

 

Ганглий имеет удлинённую форму, состоит из нескольких рядов округлых и грушевидного вида дифференцирующихся PGP 9.5⁺, различного размера нейробластов и молодых нейронов, а также отходящих пучков парасимпатических нервных волокон. В одном случае в симпатическом стволе удалось обнаружить ганглий с тирозингидроксилаза-иммунонегативными нейронами (рис. 2, c). В разных отделах СРДС (в области венозного синуса, между аортой и лёгочным стволом, вокруг главных бронхов, на задней стенке предсердий, вблизи лёгочных вен, между трахеей, пищеводом и лёгочным стволом) встречаются нервные узлы, состоящие исключительно из парасимпатических нервных элементов: нейробластов и молодых нейронов округлой, треугольной, неправильной формы (рис. 2, d). Важно отметить, что на данном сроке развития на нейронах парасимпатических ганглиев с помощью маркёра на синаптофизин уже выявляются формирующиеся синапсы (рис. 2, b).

В средостении крысы Р1 на поперечных срезах через пищевод отчётливо выявляется формирующееся ганглиозное сплетение (рис. 3). Многочисленные пучки PGP 9.5⁺ нервных волокон наблюдаются и в окружающей пищевод соединительной ткани, на границе с другими органами — бронхами, лёгочными артериями и венами.

 

Рис. 3. Нервные структуры в стенке пищевода средостения новорождённой крысы: СО — слизистая оболочка, ПО — подслизистая основа, М — мышечная оболочка стенки пищевода; * ганглиозные нервные клетки Ауэрбахова сплетения; ↑↑ — пучки нервных волокон. Иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.5; ×40 (а), ×100 (b), ×400 (c).

Важно отметить, что в рыхлой соединительной ткани СРДС присутствует также достаточно большое число долек жировой ткани, клеточные элементы которых имеют разную степень дифференцировки и иннервацию. Часть долек представлены округлой формы «эпителиальными тельцами», размеры которых достигают 150–200 мкм в диаметре. Эти дольки содержат преадипоциты (клетки-предшественники презумптивной жировой ткани) и по строению сходны с железистой тканью. Клетки «телец» имеют гиперхромное ядро и большой объём цитоплазмы. Другая часть долек построена из смешанной жировой ткани: бурой и белой. Присутствуют также дольки, состоящие из дифференцированных, преимущественно белых, адипоцитов (рис. 4). В паренхиме долек видны пучки нервных волокон и разветвления терминальных аксонов.

 

Рис. 4. Фрагменты жировой ткани средостения новорождённой крысы, отражающие разные стадии её функционального состояния и развития: а — эпителиальное тельце; b — долька смешанной жировой ткани, состоящая из бурых и белых адипоцитов. М — миокард предсердия, Эт — эпителиальное тельце, ХК — хромаффинные клетки, ↑↑ — ТН-иммунонегативные парасимпатические нейроны, НВ — нервные волокна вагусного нерва; СЖТ — долька смешанной жировой ткани, ХТ — хрящевая ткань. Иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.5 (а) и тирозингидроксилазу (b); подкраска толуидиновым синим; ×100.

 

В сердце новорождённой крысы отмечена богатая иннервация в области пучков проводящих мышечных волокон, располагающихся между краниальной полой веной и основанием ушка правого предсердия. С помощью ИГХ-реакции на белок PGP 9.5 и синаптофизин показано, что в этой области наблюдается множество нервных терминалей. Применение ИГХ-реакции на тирозингидроксилазу позволило установить, что мéньшая их часть — симпатические. Терминальная сеть, иннервирующая проводящую систему сердца, прослеживается на некотором расстоянии до разветвлений на отдельные пучки.

У новорождённой крысы уже формируется терминальное нервное сплетение. Терминальные синаптические сети, состоящие из варикозных аксонов, в небольшом числе встречаются в адвентиции главных бронхов, вокруг мелких артерий, в тельцах и дольках бурой и белой жировой ткани. В стенке пищевода, кроме ганглиозного сплетения Ауэрбаха, выявляются также фрагменты пучков терминальной сети варикозных аксонов во всех оболочках, что свидетельствует о раннем функциональном развитии иннервации этого отдела желудочно-кишечного тракта. Отдельные иммунореактивные аксоны терминальной сети отмечены в эти сроки также в миокарде ушек предсердий, в незначительной степени — в основании клапанного аппарата и в верхней части межпредсердной перегородки.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как отмечалось ранее, морфология органов средостения, относящихся к кровеносной, дыхательной, пищеварительной и иммунной системам (пищевод, магистральные сосуды, трахея, бронхи, сердце, жировая ткань и др.), изучена в онтогенезе недостаточно. Анатомо-топографическая локализация этих органов описана в известных атласах и руководствах. Большинство исследований органов грудной полости животных и человека выполнены физиологическими и клинико-инструментальными методами [13–21]. С помощью этих методов у взрослых организмов в области грудной клетки выявлена рефлекторная активность и высказано предположение о существовании тесных функциональных взаимосвязей между различными органами дыхательной и пищеварительной, сердечно-сосудистой и дыхательной, нервной и иммунной систем. Заслуживают большого внимания данные, полученные при анализе биопсийного материала, взятого из СРДС. Авторами работ [13–17] идентифицированы и описаны различного типа опухоли, развивающиеся в СРДС (невриномы, лимфобластомы, шванномы, фибробластомы и др.). С помощью электрофизиологических методов в этой зоне установлено наличие рефлексогенных зон, сходных с синокаротидной зоной.

В литературе имеются и морфологические сведения, в частности о барорецепторной рефлексогенной зоне в дуге аорты [22, 23]. Недавно опубликованы топографо-анатомические и морфометрические данные о пищеводе у плодов человека 16–22 нед развития [24].

В настоящей работе мы провели обзорное макроскопическое и микроскопическое исследование органов СРДС новорождённых крыс с помощью ИГХ-методов и оценили состояние нервных структур на этом этапе развития организма. Оригинальность методологического подхода заключалась в том, что на поперечных гистологических срезах через СРДС благодаря применению малого увеличения микроскопа (×40) можно было изучать в одном поле зрения на одном срезе одновременно несколько органов: трахею, нервы, главные бронхи, сердце, пищевод и др. В результате установлены тесные взаимоотношения перечисленных органных структур с ветвями, главным образом парасимпатических нервных волокон вагусного и возвратного нервов, в меньшей степени — симпатического ствола.

Анализ материала на микроскопическом уровне проведён с помощью нейральных маркёров (белка PGP 9.5, тирозингидроксилазы, синаптофизина) [10, 11]. Выявлены тонкие нейро-тканевые взаимоотношения, отражающие развитие иннервации на уровне синаптогенеза и формирования помимо широкопетлистых нервных сплетений терминальных синаптических сетей [3]. Впервые с помощью ИГХ-маркёров установлены особенности неравномерности развития процессов иннервации органов грудной клетки. Оказалось, что наиболее выражена она в стенке пищевода. В синусном узле правого предсердия обнаружена высокая плотность терминальной синаптической сети. Присутствие терминальных синаптических структур мы наблюдали в стенках бронхов, следующих в направлении к долевым сегментам лёгких, а также в дольках жировой ткани. Вместе с тем следует отметить, что слабоиннервированными остаются ткани левого предсердия и желудочков сердца.

Вопрос о том, почему в ранний срок постнатального развития среди органов СРДС наиболее выраженная иннервация проявляется в стенке пищевода и в области венозного синуса, точнее синусного узла, располагающегося в области проводящих кардиомиоцитов правого предсердия, требует пояснения. На наш взгляд, это связано с ранним развитием данных структур в фило- и онтогенезе. Известно, что процесс рекапитуляции берёт начало от низших хордовых бесчерепных животных. У ланцетника с замкнутой системой кровообращения уже имеются такие отделы, как кювьеровы протоки и венозный синус, сквозная кишечная трубка с тремя отделами и брюшная нервная цепочка. Отдел нервной системы, регулирующий работу желудочно-кишечного тракта, в настоящее время называется энтеральной нервной системой (ЭНС) (или метасимпатической — по А. Д. Ноздрачёву и Е. И. Чумасову [3]). Некоторые исследователи сравнивают ЭНС с ЦНС по большому количеству формирующих её нервных клеток и называют «вторым мозгом» [25]. Другие считают, что ЭНС можно считать «первым (а не вторым) мозгом» [26], поскольку в филогенезе структуры ЭНС появляются раньше нервной трубки. Предполагается также, что «первый мозг» перешёл к позвоночным животным в филогенезе от кольчатых червей — первых целомических животных, нервная система которых представлена брюшной нервной цепочкой.

Что касается синусного узла, он также развивается в филогенезе достаточно рано. Синусный узел появляется в эволюции, когда возникает замкнутый тип кровеносной системы, и описан уже у кольчатых червей. Очевидно, что иннервация этой области также появляется раньше, чем в других областях сердца.

Кроме описанных двух областей органов СРДС, в настоящей работе отмечены выраженные нервные структуры в жировой ткани бронхиальной области и в адвентиции крупных бронхов и стенок их ветвей. Установленная иннервация развивающейся жировой ткани у новорождённых крыс дополняет данные нашего предыдущего исследования [27] и показывает, что с первых суток развития нервная система регулирует функционирование развивающихся адипоцитов. В остальных тканях и органах у новорождённых крыс, как уже отмечалось, морфологические признаки иннервации очень слабо выражены. В миокарде желудочков сердца и в долевых отделах лёгкого, в стенках аорты и лёгочного ствола эти признаки также представлены весьма слабо. Последовательное развитие нервных структур данных органов будет исследовано нами в дальнейшей работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнительное изучение особенностей иннервации органов средостения крыс в ранний постнатальный период развития с помощью применения иммуногистохимических методов исследования показало, что наиболее иннервируемыми оказываются стенка пищевода и область венозного синуса сердца. Предположительно это объясняется наиболее ранним становлением данных областей в фило- и онтогенезе. Впервые в нашей работе с помощью иммуногистохимических методов представлены данные о ранней стадии формирования синаптических структур с тканями различных органов средостения.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины», документ № 122020300199-5.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Е. И. Чумасов — идея исследования, написание текста и редактирование статьи; Е. С. Петрова — проведение иммуногистохимических реакций, подготовка и написание текста статьи.

Об авторах

Евгений Иванович Чумасов

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: ua1ct@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4859-6766
SPIN-код: 2569-9148

д-р биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Елена Сергеевна Петрова

Институт экспериментальной медицины

Email: iemmorphol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0972-8658
SPIN-код: 3973-1421

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы