Immunohistochemical study of the nervous structures of the mediastinal organs of a newborn rat

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

             В ранее выполненных исследованиях в околосердечной области с помощью нейрогистологических и гистохимических методов и электронной микроскопии описано большое многообразие нервных структур: ганглиев, параганглиев, нервных сплетений, миелинизированных и немиелинизированных нервных проводников [1-4]. Было показано, что в иннервации тканей органов СРДС животных и человека принимают участие нервные волокна из различных отделов ЦНС (головного и спинного мозга), симпатического и парасимпатических звеньев автономной нервной системы (АНС) [5]. В последние десятилетия, кроме классических светооптических нейрогистологических методов и электронной микроскопии, широко используются иммуногистохимические (ИГХ) методы. Они позволяют селективно выявлять нервные аппараты различной медиаторной природы  разных отделов сердечно-сосудистой, дыхательной и пищеварительной систем как в норме, так и при патологических состояниях [7-10]. Наибольшее внимание исследователи уделяют иннервации сердца и магистральных кровеносных сосудов [6-9, 11], менее изученными по сравнению с магистральными сосудами остаются вопросы иннервации других жизненно важных органов, локализованных в СРДС: например, бронхов, пищевода, легочных и полых вен, долек жировой ткани. Мало изучены вопросы, связанные с развитием нервных аппаратов СРДС в период рождения, когда происходит переключение процесса кровообращения с плацентарного на легочное, и в первые сутки постнатального развития, когда наблюдается становление регуляции дыхания и функционирования органов сердечно-сосудистой системы.

            Целью настоящей работы явилось сравнительное иммуногистохимическое исследование иннервации органов средостения новорожденной крысы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

            Объектами исследования служили органы и ткани центрального средостения крыс Вистар в возрасте 1 сут (Р1) (n = 10). При работе с животными соблюдали международные правила Европейского сообщества по гуманному обращению с экспериментальными животными. Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/22 от 06.04.2022). Материал фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида в течение одних суток [12] и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле заливали в парафин. Парафиновые фронтальные срезы через сердечно-лёгочный комплекс толщиной 5-7 мкм изготавливали на ротационном микротоме Pfm Rotary 3003 (PFM, Германия). На срезах после депарафинирования проводили иммуногистохимические реакции на тирозингидроксилазу, белок PGP 9.5, синаптофизин. Тирозингидроксилазу – ферментный маркер катехоламинергических структур – выявляли с помощью кроличьих поликлональных антител (Abcam, Великобритания). Для выявления белка PGP 9.5 использовали поликлональные кроличьи антитела (Spring Bioscience, США). Для синаптофизина - поликлональные кроличьи антитела (MONOSAN, Нидерланды). Первичные антитела наносили на гистологические срезы на 24 ч. В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Fisher Scientific,  США). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим, гематоксилином-эозином и астровым синим. Анализ гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM 750 (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ICC 50 (Leica, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

            Прежде, чем переходить к морфологическому анализу материала необходимо отметить ряд топографических особенностей, отражающих общую макроскопическую картину СРДС у новорожденных крыс. В пределах гистологического препарата, окрашенного гематоксилином-эозином или толуидиновым синим, при малом увеличении микроскопа (х40) на продольных срезах можно видеть большинство органов средостения (mediastinum), включая сердце. На срезах отчётливо определяются стволы вагосимпатических нервов, главные  бронхи, магистральные венозные и артериальные сосуды, фрагменты пищевода, лимфатических узлов, ганглиев. Пространства между органами заполнены фасцикулярно-клеточными элементами рыхлой соединительной ткани,  формирующимися дольками жировой ткани и сосудами микроциркуляторного русла (рис.1).

            Сравнительный морфологический ИГХ-анализ позволил установить важные особенности и закономерности иннервации органов и тканей СРДС. В разных участках фасцикулярной соединительной ткани встречаются ганглии, нервные стволики и пучки нервных волокон, образующие различной плотности сплетения. С помощью ИГХ-реакции на белок PGP 9.5 и ТН выяснилось, что они имеют  различный биохимический статус,  холинергическую и/или  симпатическую природу (рис. 1). По ряду морфологических признаков нервные аппараты находятся в состоянии развития, роста и дифференцировки. Преобладающими нервными структурами оказались парасимпатические.

Рис.1. Органы центрального средостения новорожденной крысы. Б – бронхи, П –пищевод, М – миокард предсердия,  С - створки сердечного клапана, Ла –легочная артерия, Лу – лимфатический узел, Ж – жировая ткань, В – вены, Н – нервные стволы, Г – атриальный ганглий. Иммуногистохимическая реакция на PGP 9.5 (а), на тирозингидроксилазу (б). Подкраска гематоксилином (а). х40

            В нервных сплетениях СРДС, наряду с крупными ганглиями встречаются микроганглии, островки и группы хромаффинных клеток. Между главными бронхами и легочными венами постоянно выявляется несколько крупных размеров ганглиев, достигающих длины  от 150 до 300 мкм. На рисунке 2 представлен  один из атриальных нервных узлов, тесно прилежащий к задней стенке миокарда между правым и левым предсердиями. Выше над ним, видны два главных бронха и профили вен (рис 1).

Рис. 2. Парасимпатические и симпатические нервные структуры в средостении новорожденной крысы.

↑↑ - дифференцирующися синапсы преганглионарных волокон на парасимпатических нейронах ганглия, * - парасимпатические нейроны в симпатическом нервном стволе. Иммуногистохимические реакции на белок PGP 9.5 (а, г),  синаптофизин (б) и тирозингидроксилаза (в). Ув.: х400.

            Ганглий имеет удлиненную форму, состоит из нескольких рядов округлых и грушевидного вида дифференцирующихся PGP 9.5⁺ различного размера нейроблпстов и молодых нейронов и отходящих пучков парасимпатических нервных волокон. В одном случае удалось обнаружить ветвь нервного стволика симпатической цепочки, заполненного нейронами с чётко выраженной иммунореактивностью к ТН, что свидетельствует о катехоламинергической их природе.  В разных отделах СРДС (в области венозного синуса, между аортой и лёгочным стволом, вокруг главных бронхов, на задней стенке предсердий, вблизи легочных вен, между трахеей, пищеводом и лёгочным стволом) встречаются нервные узлы, состоящие исключительно из парасимпатических нервных элементов: нейробластов и молодых нейронов округлой, треугольной,  неправильной формы. Кроме того, в  нервных сплетениях средостения, нередко выявляются PGP 9.5⁺ микроганглии (состоящие из 5-10 клеток), а также небольшие скопления и группы хромаффинных клеток - нейросекреторных элементов симпато-адреналоврой системы. Последние селективно выявляются с помощью ИГХ-реакции на катехоламины и встречаются не только в сплетениях рядом с ганглиями (реже и внутри них), но и в адвентиции крупных артерий, бронхов, а также в эндоневрии нервных стволиков. Важно отметить, что на данном сроке развития  на нейронах парасимпатических ганглиях с помощью маркера на СФ выявляются формирующиеся синапсы перицеллюлярных аппаратов преганглионарных волокон (рис. 2, б).

            Кроме смешанных пучков, состоящих из парасимпатических и симпатических проводников, в СРДС  встречаются стволики и пучки, состоящие исключительно из симпатических постганглионарных нервных волокон. Они, вероятно, приходят в СРДС из ганглиев пограничных симпатической цепочки, часть  дополняет местные нервные сплетения, а другая часть направляется транзитом в различные отделы сердца. В некоторых таких пучках встречаются небольшие группы парасимпатических или холинергических нейроцитов (рис. 2, в).

            В средостении крысы Р1 постоянно обнаруживаются фрагменты пищевода (рис. 3, а). В его мышечной оболочке четко прослеживаются ганглиозное сплетение Ауэрбаха, которое представлено цепочками нейробластов и молодых нейронов, в мышечной стенке встречаются терминальные аксоны (рис. 3, б). Многочисленные пучки PGP 9.5⁺ нервных волокон наблюдаются и в окружающей пищевод соединительной ткани, на границе и вблизи с другими соседними органами – бронхами,   легочными артериями и венами.

Рис. 3. Нервные структуры в стенке пищевода средостения новорожденной крысы. СО – слизистая оболочка, ПО – подслизистая основа, М – мышечная оболочка стенки пищевода; * - ганглиозные нервные клетки ауэрбахова сплетения; ↑↑ - пучки нервных волокон. Иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.5. х40 (а), х400 (б)

            Важно отметить, что в рыхлой соединительной ткани СРДС присутствует также достаточно большое количество долек жировой ткани, клеточные элементы которых имеют разную степень дифференцировки и иннервацию. Одни представлены тельцами, содержащими преадипоциты (клетки-предшественники презумптивной эпикардиальной жировой ткани), другие дольки построены из смешанной жировой ткани (бурой и белой), третьи – состоят из дифференцированных, преимущественно белых адипоцитов (рис. 4). В паренхиме долек видны пучки нервных волокон и разветвления терминальных аксонов.

Рис. 4.  Фрагменты жировой ткани средостения новорожденной крысы, отражающие разные стадии её функционального состояния и развития. а – эпителиальное тельце, б – долька смешанной жировой ткани, состоящая из бурых и белых адипоцитов. М – миокард предсердия, Эт – эпителиальное тельце, ХК –  хромаффинные клетки, ↑↑- ТН-иммунонегативные парасимпатические нейроны; НВ - нервные волокна вагусного нерва; СЖТ – долька смешанной жировой ткани, ХТ – хрящевая ткань. Иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.5 (а) и тирозингидроксилазу (б). х100

            В сердце новорожденной крысы отмечена богатая иннервация в области проводящего миокарда, располагающегося между краниальной полой веной и основанием ушка правого предсердия. С помощью ИГХ-реакции на белок PGP 9.5, синаптофизин и TH установлено, что бóльшая часть нервных терминалей является парасимпатическими, а мéньшая -  симпатическими. Терминальная сеть, иннервирующая  проводящий миокард прослеживается на некотором расстоянии до разветвлений на отдельные пучки.

            У новорожденной крысы уже формируется терминальное нервное сплетение. Терминальные синаптические сети, состоящие из варикозных аксонов, в небольшом числе  встречаются в адвентиции главных бронхов, вокруг мелких артерий, в эпителиоморфных тельцах и дольках бурой и белой жировой ткани. В стенке пищевода, кроме ганглиозного сплетения Ауэрбаха, выявляются также фрагменты пучков терминальной сети варикозных аксонов во всех оболочках, что свидетельствует о раннем функциональном развитии иннервации этого отдела ЖКТ. Отдельные иммунореактивные парасимпатические и симпатические аксоны терминальной сети отмечены в эти сроки также в миокарде ушек предсердий, в незначительной степени в основании клапанного аппарата и в верхней части межпредсердной перегородки.

ОБСУЖДЕНИЕ

            Как отмечалось ранее, иннервация органов средостения, относящихся к кровеносной, дыхательной, пищеварительной и иммунной системам, изучена недостаточно. Большинство исследований, посвященных проблемам физиологии и патологии околосердечной области животных и человека (СРДС), выполнено клинико-инструментальными методами с помощью «игольчатых биопсий», цитологического анализа мазков, радиографии с целью диагностики различных опухолей (тимом, лимфом, нейробластом и др.) [13-17]. Для изучения нервной регуляция магистральных сосудов СРДС часто использовались электрофизиологическе подходы и методы [18-21]. По данным цитируемой литературы известно, что ветви стволов блуждающих нервов, диафрагмальных, возвратных и симпатической цепочки образуют в грудной полости несколько сплетений: грудное аортальное, сердечное, легочное и пищеводное. Каждое из них может представлять выраженную рефлексогенную зону, раздражение которой ведет к нарушению функции тех или иных органов грудной полости. Данные нашего морфофункционального исследования с одной стороны подтверждают эти факты, а с другой - показывают, что органы СРДС объединены между собой не только фасцикулярной соединительной тканью, но и нейронными тесными связями. По данным клиницистов и физиологов,  раздражение, например, пищеводного сплетения влияет на функцию сердца и лёгких, вызывая ответные реакции: в одних случаях – кашля, в других изменения частоты сердечного ритма. В связи с этим ранения грудной клетки часто сопровождаются выраженным болевыми ощущениями и шоком.  Полагают, что нервные сплетения в СРДС представляют собой рефлексогенные зоны грудной полости, сходные с синокаротидной зоной. Настоящее исследование дополняет имеющиеся в литературе данные, полученные результаты подтверждают на морфологическом уровне связь нервных аппаратов, иннервирующих разные органы, уже у новорожденных крыс. Нервные волокна локализуются вокруг органов средостения, объединяя их в структурном и функциональном отношении. Стволики и пучки нервных волокон выявлены в области полых вен, между аортой и легочным стволом, на границе атриовентрикулярной поверхности задней стенки миокарда предсердий, вокруг главных бронхов.

            Кроме того, в настоящем исследовании показано, что в ранний срок постнатального развития наиболее иннервируемыми оказываются органы пищеварительного тракта (пищевод) и дыхательной системы. В миокарде желудочков сердца и респираторных отделах легких на данной стадии развития перечисленные нервные аппараты, как правило, редко встречаются или отсутствуют.

         Микроскопический анализ тканей и органов позволил визуализировать другой тип узкопетлистых сплетений, известных как «основное терминальное сплетение», построенных из пучков Ремака. Они состоят из тончайших варикозных аксонов парасимпатической и симпатической природы. Варикозные аксоны представляют собой дистантные синапсы типа (en passant) и выполняют различные функции. Эта полифункциональная терминальная сеть, по нашему мнению, может выполнять функции «рефлексогенных зон», регистрируемых электрофизиологическими и клиническими методами [22; 23].

            Терминальные синаптические сети в СРДС наблюдаются в перибронхиальной и жировой ткани, вокруг мелких артерий и артериол.  Но особенно хорошо выражены в проводящем миокарде венозного синуса,  в ауэрбаховом ганглиозном сплетении и мышечной оболочке пищевода. Отдельные иммунореактивные парасимпатические и симпатические аксоны терминальной сети отмечены в эти сроки также в миокарде ушек предсердий, в незначительной степени в основании клапанного аппарата и в верхней части межпредсердной перегородки.

            В настоящей работе с помощью нейроиммуногистохимических маркеров обнаружена интенсивная иннервация проводящего миокарда  синусного узла.  Она осуществляется преимущественно терминальными варикозными аксонами постганглионарных парасимпатических и в меньшей степени симпатических волокон. Источниками  их происхождения, по нашим данным, служат нейроны крупного атриального ганглия, локализующегося рядом с синусным узлом,  пучки вагосимпатического ствола, а также приходящие извне терминали нервных волокон нейроцитов ганглиев пограничной симпатической цепочки. Полученные данные служат подтверждением того, что процессы автоматизма проводящего миокарда,  изменения объёма наполнения кровью правого предсердия, наличие механо- и баро-рецепторов в этой области, и другие функции регулируются различными отделами нервной системы (ЦНС, ПНС, АНС).

            Благодаря сравнительному исследованию с применением ИГХ-реакций к маркеру симпатических структур – ТН, и белку PGP 9.5, при исследовании нервных сплетений СРДС впервые показано, что в некоторых симпатических пучках встречаются многочисленные парасимпатические нейроны, иммунонегативные к ТН.  Отмечено, что в период новорожденности  формируется эпикардиальное  нервное сплетение. У новорожденных крыс отмечена иннервация бурой и смешанной жировой ткани  в различных участках СРДС, что согласуется с данными наших предыдущих исследований [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

            В настоящей работе проведено сравнительное изучение особенностей иннервации органов средостения в ранний постнатальный период развития крыс с помощью применения иммуногистохимических методов исследования. Объектами исследования служили фронтальные срезы через сердечно-лёгочный комплекс крыс в возрасте 1 сут (Р1). Нервные структуры средостения изучали с применением иммуногистохимических нейрональных маркеров: белка PGP 9.5, тирозингидроксилазы, и синаптофизина. С помощью окраски толуидиновым синим показано, что на срезах  верхнего и среднего отделов СРДС локализованы главные бронхи, пищевод, магистральные артериальные и венозные сосуды, дольки жировой ткани, лимфатические узлы и небольшие фрагменты прилежащих сегментов легких и сердце. В интерстиции с помощью ИГХ-методов выявлены ганглии, микроганглии, нервные стволики и пучки нервных волокон парасимпатической и симпатической принадлежности. Сравнительный анализ на белок PGP 9.5 и тирозингидроксилазу показал, что преобладающими в исследованных отделах СРДС являются холинергические структуры. С помощью реакции на синаптофизин - специфический маркер дистантных синапсов en passant основной терминальной   сети - удалось обнаружить высокую плотность распределения синаптических структур, отражающих функциональную активность  иннервации  тканей в органах СРДС. Установлено что у крыс Р1 в верхнем и среднем СРДС первые синаптические окончания регистрируются в интрамуральных ганглиях, в смешанных дольках жировой ткани, в тканях стенки пищевода, его мышцах, в слизистой оболочке бронхов, вокруг мелких артерий и артериол. Особенно выраженная иннервация и синаптофизин-иммунореактивные терминали обнаружены в проводящем миокарде  правого предсердия.

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного научного учреждения “Институт экспериментальной медицины”, No документа 122020300199-5.

Funding source. This work was state budget funded and implemented within the governmental assignment to the Institute of Experimental Medicine, Document No 122020300199-5.

Информированное согласие на участие в исследовании. Все участники исследования до включения в исследование добровольно подписали форму информированного согласия, утвержденную в составе протокола исследования этическим комитетом.

Patients’ consent. Written consent was obtained from all the study participants before the study screening in according to the study protocol approved by the local ethic committee.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов: Е.И. Чумасов — идея исследования, написание текста и  редактирование статьи. Е.С.Петрова – проведение иммуногистохимических реакций, подготовка и  написание текста статьи.

Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution: E.I.Chumasov — research idea, writing the text and editing the article; E.S.Petrova - immunohistochemical reactions, preparation and writing of the text of the article. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

About the authors

Eugene Chumasov

Author for correspondence.
Email: ua1ct@mail.ru
Russian Federation

Elena Petrova

Email: iemmorphol@yandex.ru

References

Supplementary files