Применение автоматических систем для создания тканевых микроматриц в онкоморфологических исследованиях.

Полный текст

Введение

Тканевые микроматрицы (ТМА) - это современный метод высокопроизводительного анализа, позволяющий исследовать десятки образцов архивированных парафиновых блоков на одном предметном стекле. Впервые метод ТМА был предложен в 1986 году американским патологом H. Battifora, сам ученый называл своей метод «многоопухолевый тканевой блок» (multitumor tissue block) [1] и с тех пор метод получил широкое распространение в онкоморфологических исследованиях для валидации диагностических и прогностических биомаркеров [2, 3], для исследовательских работ [4], а также для контроля качества иммуногистохимических (ИГХ) исследований [5].

Ключевыми преимуществами ТМА являются экономия времени и расходных материалов, стандартизация условий окрашивания, сохранение ценного архивного материала и возможность одновременного анализа большого количества образцов [6]. Однако традиционное ручное изготовление ТМА является трудоемким процессом, требующим высокой квалификации и значительных временных затрат [7]. Для повышения эффективности и стандартизации процесса конструирования ТМА были разработаны автоматизированные системы, которые постепенно вытесняют ручные методы в научных и клинико-диагностических лабораториях [8, 9].

Важно отметить, что на момент подготовки данной публикации данные приборы не имеют регистрационного удостоверения (РУ) в Российской Федерации (РФ), что следует учитывать при планировании их использования в клинической практике.

Материалы и методы

Автоматические системы для конструирования ТМА представляют собой высокотехнологичные приборы, обеспечивающие точное и быстрое изготовление ТМА-блоков из десятков и сотен образцов тканей [7]. Основными компонентами таких систем являются блок для автоматического извлечения тканевых цилиндров из донорских парафиновых блоков и переноса их в блоки-реципиенты, высокоточный микроманипулятор для позиционирования тканевых цилиндров, система контроля глубины погружения тканевой цилиндров (лазерный датчик или механический зонд) и специализированное программное обеспечение для создания виртуальной схемы ТМА [10], что изображено на рис. 1.

Процесс автоматического изготовления ТМА начинается с загрузки виртуальной схемы расположения тканевых цилиндров в блоке-реципиенте. Современные программы для дизайна ТМА позволяют задавать различные параметры, такие как диаметр и шаг тканевых цилиндров, их количество и расположение, а также аннотировать каждый тканевой цилиндр индивидуально [7]. На основе виртуальной схемы прибор автоматически формирует в блоке-реципиенте отверстия заданного диаметра, что отражено на рис. 2.

Далее оператор последовательно устанавливает на прибор донорские блоки и с помощью микроманипулятора позиционирует панч-иглу над областью интереса, которая выбирается под контролем среза, окрашенного гематоксилином и эозином, в каждом блоке [11] (рис. 2). Прибор автоматически извлекает тканевой цилиндр заданного диаметра (обычно от 0,6 до 2 мм) и переносит его в соответствующее отверстие блока-реципиента.

Рис. 1. Устройство для автоматического позиционирования панч-иглы
А – панч-игла; Б – гистологический препарат, окрашенный гематоксилином и эозином, с отмеченной областью интереса, находящийся в центре ротатора для позиционирования; В – блок-реципиент; Г – блок-донор №1; Д – блок-донор №2
Система контроля глубины погружения обеспечивает точное позиционирование каждого тканевого цилиндра на одном уровне, что важно для получения качественных срезов [12].

Рис. 2. Процесс позиционирования панч-иглы

После завершения сбора тканевых целиндров блок-реципиент переплавляется для фиксации и затем охлаждается. Полученный ТМА-блок нарезается на серийные срезы толщиной 4-5 мкм, которые затем могут быть использованы для гистологического, ИГХ и FISH-исследований [13]. Микропрепараты, изготовленные при помощи данной технологии изображены на рис. 3.

Рис. 3. Микропрепараты (слева направо): микропрепараты с иммуногистохимическими реакциями (маркеры NKX2.2, CD99); микропрепарат с ТМА-матрицей (ГиЭ); микропрепараты с отмеченными зонами интереса (ГиЭ)

Важным аспектом при создании ТМА является толщина тканевых цилиндров. Для сохранения оригинального диагностического материала часто используются дополнительные блоки от того же случая. Это стандартная практика, позволяющая проводить исследования без ущерба для первичной диагностики.

В нашей лаборатории автоматическая система для конструирования ТМА используется как для научных, так и для клинико-диагностических целей (на момент подготовки данной публикации данные приборы не имеют РУ в РФ). В частности, нами была создана ТМА из 106 случаев саркомы Юинга (СЮ) [14] и других недифференцированных круглоклеточных сарком. Из каждого случая были отобраны 2 репрезентативных цилиндра опухолевой ткани диаметром 1 мм и перенесены в парафиновые блоки-реципиенты. Полученные ТМА-срезы были окрашены гематоксилином и эозином для оценки морфологических признаков, также было проведено ИГХ исследование с антителами к CD99, NKX2.2, BCOR, SATB2, TLE1, WT1, ETV4, Desmin, Myogenin, MyoD1, PanCK  для анализа фенотипа СЮ и других недифференцированных круглоклеточных сарком с целью разработки алгоритма дифференциальной диагностики. Качество ТМА-срезов и результаты ИГХ оценивались независимо двумя врачами-патологоанатомами.

Результаты представлены на рис. 4.

Рис. 4. Результаты исследования когорты СЮ: препараты, окрашенные гематоксилином и эозином и препараты с ИГХ исследованием (показаны только позитивные маркеры CD99 и NKX2.2)

Обсуждение

Внедрение автоматических систем для конструирования ТМА открывает новые возможности для стандартизации и ускорения онкоморфологических исследований. По сравнению с ручным методом, автоматическое изготовление ТМА имеет ряд преимуществ [8]:

1. Более высокая точность и воспроизводимость отбора тканевых цилиндров за счет использования высокоточной механики и систем контроля глубины [3].
2. Значительная экономия времени квалифицированного персонала, особенно при работе с большим количеством образцов [4].
3. Снижение риска перекрестной контаминации между образцами и повреждения тканей благодаря минимизации ручных манипуляций [9].
4. Возможность гибкого дизайна ТМА с различными параметрами тканевых цилиндров и их расположения с помощью специализированного ПО [7].
5. Маркировка и аннотация отдельных тканевой цилиндров для последующего сопоставления морфологической картины, результатов ИГХ и FISH [15].

Следует отметить, что ТМА служит своего рода универсальным контролем. Хотя не все фрагменты могут характеризоваться положительной реакции с антителом для конкретного случая, их ценность заключается в возможности одновременного анализа множества образцов. Это особенно важно при проведении крупномасштабных исследований.

Экономия времени при использовании автоматических систем требует учета дополнительных затрат на программирование и обслуживание оборудования. Тем не менее, наш опыт показывает, что при правильной организации процесса и регулярном использовании автоматизированные системы позволяют значительно оптимизировать работу, особенно при обработке большого количества образцов.

В нашем исследовании применение автоматической системы для конструирования ТМА позволило эффективно проанализировать большую выборку из 106 случаев сарком Юинга и других недифференцированных круглоклеточных сарком с целью выявления новых сочетаний диагностических маркеров [14]. 

Несмотря на очевидные преимущества автоматических систем для конструирования ТМА, для получения достоверных результатов важно соблюдать ряд методологических требований, таких как картирование с помощью тканей отличных по строению от исследуемой [3], репрезентативность отбора тканевых цилиндров с учетом гетерогенности опухолей [2], достаточное количество тканевых цилиндров из каждого случая (не менее 2-3) [6], а также стандартизация протоколов окрашивания и интерпретации результатов [4, 5]. 

Заключение

Тканевые микроматрицы являются инструментом современной онкоморфологии, позволяющим эффективно исследовать большие архивные серии образцов для валидации диагностических и прогностических биомаркеров, для исследовательских работ, а также для контроля качества ИГХ исследований.

Автоматизация процесса изготовления ТМА с помощью специализированных систем обеспечивает стандартизацию преаналитического этапа и повышает производительность лаборатории по сравнению с ручными методами.

Опыт нашей лаборатории показывает, что внедрение автоматических систем для конструирования ТМА позволяет существенно оптимизировать работу и получать высококачественные срезы для различных видов морфологических исследований. При этом для обеспечения достоверности результатов необходимо соблюдать ряд методологических требований по отбору репрезентативного материала и стандартизации протоколов.

Дальнейшее развитие и более широкое применение автоматических систем для конструирования ТМА будет способствовать повышению эффективности и воспроизводимости онкоморфологических исследований, а также ускорению трансляции научных достижений в клиническую практику.

Об авторах

Инна Андреевна Парфенова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: pathmorf@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-0667-9352

Старший лаборант отделения патологической анатомии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Россия, Россия, Москва, ул. Саморы Машела, д.1

София Александровна Ерышова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Email: sofya.eryshova@dgoi.ru
ORCID iD: 0009-0008-8862-2619

медицинский техник отделения патологической анатомии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Россия, Россия, Москва, ул. Саморы Машела, д.1

Список литературы

Дополнительные файлы