Automated systems for creating tissue microarrays in oncomorphological studies

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность применения автоматизированных систем, позволяющих создавать тканевые микроматрицы (ТМА) для онкоморфологических исследований, обусловлена необходимостью повышения точности и эффективности анализа большого количества тканевых образцов. С помощью ТМА можно исследовать десятки и сотни образцов на одном предметном стекле, что существенно ускоряет диагностику и исследовательские процессы в онкологии [1]. Метод ТМА, предложенный H. Battifora в 1986 году, широко используется для валидации диагностических и прогностических биомаркеров, контроля качества иммуногистохимических (ИГХ) исследований и других научных целей [2, 3].

Трудности при традиционном ручном изготовлении ТМА в основном связаны с трудоёмкостью процесса, требующего высокой квалификации персонала, и значительными временными затратами [4]. Автоматизация процесса создания ТМА позволяет преодолеть эти трудности, обеспечивая высокую точность и значительную экономию времени, а также минимизацию риска перекрёстной контаминации [5, 6]. Однако, несмотря на очевидные преимущества автоматизированных систем, их использование в клинической практике в Российской Федерации ограничено отсутствием регистрационных удостоверений [7].

Ранее опубликованные результаты исследований подтверждают эффективность автоматизированных систем для конструирования ТМА. Например, такие системы успешно использовались для анализа биомаркеров в опухолях различных типов [3], обеспечивая высокую точность результатов. Подтверждённая исследованиями экономия ресурсов и времени при использовании автоматизированных систем делает их привлекательными для лабораторий с большим потоком образцов и значительным объёмом работы [5].

Таким образом, внедрение автоматизированных систем для создания ТМА в практику онкоморфологических исследований является значительным шагом вперёд, способствующим повышению эффективности и стандартизации исследований. Тем не менее, для полноценной интеграции данных систем в клиническую практику необходимо решить вопросы, связанные с регистрацией и стандартизацией использования такого оборудования в Российской Федерации [7].

Настоящий обзор посвящён рассмотрению возможностей и преимуществ автоматизированных систем для создания тканевых микроматриц по сравнению с ручным методом, с акцентом на их применение в анализе саркомы Юинга и других недифференцированных круглоклеточных сарком.

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ АВТОМАТИЗИРОВАННЫХ СИСТЕМ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТКАНЕВЫХ МИКРОМАТРИЦ

Автоматизированные системы для конструирования ТМА представляют собой высокотехнологичные приборы, обеспечивающие точное и быстрое изготовление микроматриц из десятков и сотен образцов тканей [4]. Основные модули, входящие в состав таких систем: блок для автоматического извлечения тканевых цилиндров из донорских парафиновых блоков и переноса их в блоки-реципиенты (рис. 1); высокоточный микроманипулятор для позиционирования тканевых цилиндров; система контроля глубины погружения тканевых цилиндров (лазерный датчик или механический зонд); специализированное программное обеспечение для создания виртуальной схемы ТМА [8].

 

Рис. 1. Устройство для автоматического позиционирования панч-иглы: А — панч-игла; Б — гистологический препарат с отмеченной областью интереса, препарат окрашен гематоксилином и эозином и находится в центре ротатора для позиционирования; В — блок-реципиент; Г — блок-донор №1; Д — блок-донор №2.

Fig. 1. Device for automatic punch needle positioning: A, punch needle; Б, histological slide with marked area of interest, stained with hematoxylin and eosin, placed in the center of the rotator for positioning; В, recipient block; Г, donor block 1; Д, donor block 2.

 

Процесс автоматизированного изготовления ТМА начинается с загрузки виртуальной схемы расположения тканевых цилиндров в блоке-реципиенте. Современные программы для дизайна ТМА позволяют задавать различные параметры: диаметр тканевых цилиндров, расстояние между ними, их количество и расположение, а также индивидуально аннотировать каждый образец [4]. На основе виртуальной схемы прибор автоматически формирует в блоке-реципиенте отверстия заданного диаметра для размещения каждого из образцов (рис. 2).

 

Рис. 2. Процесс позиционирования панч-иглы с помощью программного обеспечения.

Fig. 2. Software-guided punch needle positioning.

 

Далее оператор последовательно устанавливает на прибор донорские парафиновые блоки и с помощью микроманипулятора позиционирует панч-иглу над областью интереса, выбранной в каждом образце на основе контрольного среза, окрашенного гематоксилином и эозином (см. рис. 2) [9]. Прибор автоматически извлекает тканевой цилиндр заданного диаметра (обычно от 0,6 до 2 мм) из донорского блока и переносит его в соответствующее отверстие блока-реципиента. Система контроля глубины погружения обеспечивает точное позиционирование каждого тканевого цилиндра на одном уровне, что особенно важно для получения качественных срезов [10].

После завершения сбора тканевых цилиндров блок-реципиент переплавляется для их фиксации, а затем охлаждается. Полученный ТМА-блок нарезается на серийные срезы толщиной 4–5 мкм, которые можно использовать для гистологических и ИГХ исследований, а также для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) [11]. Примеры микропрепаратов, изготовленных при помощи данной технологии изображены на рис. 3.

 

Рис. 3. Общий вид микропрепаратов: a–c — микропрепараты с отмеченными зонами интереса, окрашивание гематоксилином и эозином; d — микропрепарат с тканевой микроматрицей, окрашивание гематоксилином и эозином; e, f — микропрепараты, окрашенные иммуногистохимическим методом на CD99 и на транскрипционный фактор NKX2.2 соответственно.

Fig. 3. Overview of the microslides: a–c, microslides with marked areas of interest, stained with hematoxylin and eosin; d, microslide with tissue microarray, stained with hematoxylin and eosin; e, f, microslides stained by immunohistochemistry for CD99 and transcription factor NKX2.2, respectively.

 

Важным аспектом при создании ТМА является высота тканевых цилиндров. Чтобы сохранить оригинальный диагностический материал, для создания ТМА часто используют дополнительные парафиновые блоки того же случая. Это стандартная практика, позволяющая проводить исследования без ущерба для первичной диагностики.

В нашей лаборатории автоматизированная система для конструирования ТМА используется как для научных, так и для клинико-диагностических целей¹. В частности, нами была создана ТМА из 106 случаев саркомы Юинга [12] и других недифференцированных круглоклеточных сарком (саркома с альтерациями гена BCOR и CIC-перестроенная саркома). Для каждого случая из образцов были отобраны по 2 репрезентативных цилиндра опухолевой ткани диаметром 1 мм и перенесены в парафиновые блоки-реципиенты. Полученные ТМА-срезы окрашивали гематоксилином и эозином для оценки морфологических признаков. Для разработки алгоритма дифференциальной диагностики было проведено ИГХ исследование на автоматическом иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA (Roche, Швейцария) с использованием антител к различным маркерам, применяемым для анализа фенотипа саркомы Юинга и других недифференцированных круглоклеточных сарком: CD99 (Cell Marque, США), NKX2.2 (BioSB, США), BCOR (Cell Marque, США), SATB2 (Santa Cruz, США), TLE1 (Cell Marque, США), WT1 (Cell Marque, США), ETV4 (Invitrogen, США), десмину (Cell Marque, США), миогенину (Cell Marque, США), MyoD1 (Cell Marque, США) и панцитокератину (Ventana, США). Поскольку исследование выполнено ретроспективно, набор иммуногистохимических маркеров выбран с учётом того, что в исследование были включены образцы наиболее часто встречающихся вариантов круглоклеточных сарком. Качество ТМА-срезов и результаты окрашивания оценивали независимо два врача-патологоанатома.

Применение автоматизированной системы для конструирования ТМА в нашем исследовании позволило эффективно проанализировать большую выборку (106 случаев) саркомы Юинга и других недифференцированных круглоклеточных сарком, а также обнаружить новые сочетания диагностических маркеров. Результаты ИГХ исследования показали различия в экспрессии маркеров между саркомой Юинга, саркомой с альтерациями гена BCOR и CIC-перестроенной саркомой. Характерную для саркомы Юинга коэкспрессию CD99 и NKX2.2 наблюдали в 94% случаев (рис. 4), при этом такое сочетание маркеров не было выявлено в других типах опухолей. Саркома с альтерациями гена BCOR отличалась коэкспрессией BCOR, TLE1 и SATB2 в 80% случаев. Для CIC-перестроенной саркомы была характерна коэкспрессия ETV4 и WT1, хотя она детектировалась только в 25% случаев. На основании полученных результатов составлен алгоритм дифференциальной диагностики опухолей, как внутри группы, так и с другими круглоклеточными опухолями [12].

 

Рис. 4. Результаты исследования пациентов с саркомой Юинга: ГиЭ — препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, ×40; CD99 — препараты, окрашенные иммуногистохимическим методом на CD99, ×40; NKX2.2 — препараты, окрашенные иммуногистохимическим методом на транскрипционный фактор NKX2.2, ×40. Показаны только препараты с положительной реакцией с антителами к маркерам CD99 и NKX2.2.

Fig. 4. Findings in patients with Ewing sarcoma: H&E, slides stained with hematoxylin and eosin, ×40; CD99, slides stained with immunohistochemistry for CD99, ×40; NKX2.2, slides stained with immunohistochemistry for transcription factor NKX2.2, ×40. Only slides positive for antibodies against CD99 and NKX2.2 markers are presented, ×40.

 

ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ АВТОМАТИЗИРОВАННЫХ СИСТЕМ

Внедрение автоматизированных систем для конструирования ТМА открывает новые возможности для стандартизации и ускорения онкоморфологических исследований. По сравнению с ручным методом, автоматизированное изготовление ТМА имеет ряд преимуществ [6]:

• более высокая точность отбора тканевых цилиндров за счёт использования высокоточной механики и систем контроля глубины [3];
• значительная экономия времени квалифицированного персонала, особенно при работе с большим количеством образцов [5];
• благодаря минимизации ручных манипуляций снижается риск повреждения тканей и перекрёстной контаминации между образцами [7];
• возможность гибкого дизайна ТМА и выбора различных параметров тканевых цилиндров и их расположения с помощью специализированного программного обеспечения [4];
• индивидуальная маркировка и аннотация тканевых цилиндров для последующего сопоставления морфологической картины, результатов ИГХ исследования и FISH [13].

Следует отметить, что ТМА служат своего рода универсальным контролем. Хотя не все образцы могут давать положительную реакции с антителами к маркерам, характерным для конкретного диагностического случая, ценность ТМА заключается в возможности одновременного анализа большого числа образцов, что особенно важно для крупномасштабных исследований.

Использование автоматизированных систем требует учёта дополнительных затрат времени на программирование и обслуживание оборудования. Тем не менее, наш опыт показывает, что при правильной организации процесса и регулярном использовании автоматизированные системы позволяют значительно оптимизировать работу, особенно при обработке большого количества образцов.

Несмотря на очевидные преимущества использования автоматизированных систем для конструирования ТМА, для получения корректных результатов важно соблюдать ряд методологических требований: проводить картирование, используя ткани, отличающиеся по строению от исследуемой [3]; соблюдать репрезентативность отбора тканевых цилиндров с учётом гетерогенности опухолей [2]; исследовать достаточное количество тканевых цилиндров из каждого случая (не менее 2–3) [14]; проводить стандартизацию протоколов окрашивания и интерпретации результатов [5, 15].

Опыт нашей лаборатории показывает, что внедрение автоматизированных систем для конструирования ТМА существенно оптимизирует процесс одновременного получения высококачественных срезов большого количества образцов для всех основных видов морфологических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тканевые микроматрицы — это инструмент современной онкоморфологии, позволяющий эффективно исследовать большие архивные серии образцов для валидации диагностических и прогностических биомаркеров как в исследовательских целях, так и для контроля качества иммуногистохимических исследований.

Автоматизация процесса конструирования ТМА с помощью специализированных систем обеспечивает стандартизацию преаналитического этапа и повышает производительность лаборатории по сравнению с ручными методами.

Дальнейшее развитие и более широкое применение автоматизированных систем для конструирования ТМА будет способствовать повышению эффективности онкоморфологических исследований и ускорению трансляции научных достижений в клиническую практику.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. И.А. Парфенова — определение концепции, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи; С.А. Ерышова — определение концепции, проведение исследования, написание черновика рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы выражают благодарность врачу-патологоанатому патологоанатомического отделения ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачёва» МЗ РФ Сидорову Илье Владимировичу и заведующему патологоанатомическим отделением ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачёва» МЗ РФ Коновалову Дмитрию Михайловичу за предоставление клинического материала и ценные консультации в ходе проведения исследования пациентов с недифференцированными круглоклеточными саркомами. Благодаря их экспертным знаниям и поддержке удалось успешно выполнить данную работу.

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима, новые данные не собирали и не создавали.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: I.A. Parfenova: conceptualization, methodology, writing — original draft, writing — review & editing; S.A. Eryshova: conceptualization, methodology, formal analysis, writing — original draft. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgements: The authors express their gratitude to Dr. Ilya V. Sidorov, pathologist at the Pathology Department of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology, and Dr. Dmitry M. Konovalov, Head of the Pathology Department at the same institution, for providing clinical material and valuable consultations during the research in patients with undifferentiated round cell sarcomas. Thanks to their expert knowledge and support, this work was successfully completed.

Funding sources: No funding.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewers, a member of the Editorial Board, and the in-house scientific editor.

¹ На момент подготовки данной публикации приборы для автоматизированного создания тканевых микроматриц не имеют регистрационного удостоверения на территории Российской Федерации.

About the authors

Inna A. Parfenova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center for Children's Hematology, Oncology and Immunology

Author for correspondence.
Email: pathmorf@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-0667-9352
Russian Federation, Moscow

Sofia A. Eryshova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center for Children's Hematology, Oncology and Immunology

Email: sofya.eryshova@dgoi.ru
ORCID iD: 0009-0008-8862-2619
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files