The use of L-dopa induces the resistance of Mauthner neurons to the neurotoxic action of beta-amyloid

Nadezhda R. Tiras; Тирас Надежда Романовна; Irina B. Mikheeva; Михеева Ирина Борисовна; Gulnara Z. Mikhailova; Михайлова Гульнара Зульфатовна; Nadezhda A. Penkova; Пенькова Надежда Александровна; Sergey S. Khutsyan; Хуцян Сергей Суренович

doi:10.17816/morph.89904

The use of L-dopa induces the resistance of Mauthner neurons to the neurotoxic action of beta-amyloid

Authors: Tiras N.R.¹, Mikheeva I.B.¹, Mikhailova G.Z.¹, Penkova N.A.¹, Khutsyan S.S.¹
Affiliations:
1. Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of the Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 160, No 1 (2022)
Pages: 11-19
Section: Original Study Articles
URL: https://j-morphology.com/1026-3543/article/view/89904
DOI: https://doi.org/10.17816/morph.89904
ID: 89904

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

BACKGROUND: Mauthner goldfish (Carassius auratus (L)) cells serve as model objects for studying brain pathologies at the level of identified neurons and their individual dendrites. L-dopa may be an agent that decelerates the destruction of neurons caused by the toxic effects of beta-amyloid.

AIMS: To study the three-dimensional structure of Mauthner neurons in goldfish and the ultrastructure of their afferent synapses under the influence of L-dopa and the toxic 25–35 fragment of beta-amyloid.

MATERIAL AND METHODS: This study was performed on the Mauthner neurons of goldfish fry (n=12) by using light and electron microscopy. Serial sections 3 μm thick were used to identify and integrally reconstruct the structure of Mauthner neurons; determine the volume of the soma and ventral and lateral dendrites; and study the structure of afferent synapses.

RESULTS: The use of L-dopa stabilized the size of the soma and ventral dendrites. The reduction in the volume of lateral dendrites was accompanied either by an increase in the volume of their branches under the action of beta-amyloid followed by that of L-dopa or by an increase in the volume of medial dendrites under the action of L-dopa followed by that of beta-amyloid. Although pathological changes in the ultrastructure of neurons and afferent synapses were not found, signs of early amyloidosis were detected.

CONCLUSION: The use of L-dopa decelerates the degeneration of Mauthner neurons. The resistance of whole neurons to the neurotoxic action of beta-amyloid has been suggested to be due to the mechanism of structural homeostasis aiming at the compensatory restoration of the morphological organization of neurons.

Keywords

Mauthner neurons, synapses, L-dopa, beta-amyloid

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Дендриты выполняют ключевые функции в интеграции сигналов, поступающих к нейрону, в формировании и поддержании сетевых взаимодействий, в обеспечении синаптической пластичности. Их структурная организация существенно изменяется при специфической стимуляции и деафферентации, патологических мозговых нарушениях, а также в ходе эволюционных преобразований мозга [1, 2]. Дендриты первыми подвергаются локальной деструкции и дегенерации в условиях токсического воздействия бета-амилоида. При болезни Альцгеймера и моделировании этого заболевания дендриты деформируются в ткани мозга плотными отложениями, состоящими преимущественно из бета-амилоида (гистопатологический индикатор болезни), меняют траекторию роста, истончаются, утрачивают ветвления и синапсы [1].

Проведение экспериментов на инъекционных моделях амилоидоза показывает, что дендриты могут быть хорошими объектами для изучения влияния бета-амилоида на характер деструктивного процесса, его обострение, замедление или предотвращение. Так, применение бета-амилоида приводит к уменьшению диаметра и длины дендритов маутнеровских нейронов (МН) золотой рыбки. Сочетание бета-амилоида и длительной вестибулярной или оптокинетической стимуляции вызывает сильную дистрофию латерального (ЛД) и вентрального (ВД) дендритов, сопровождаемую патологическими изменениями образованных ими синапсов [3].

В коре млекопитающих дегенерация дендритов и синапсов развивается вследствие вызванного бета-амилоидом снижения уровня дофамина, напрямую влияющего на механизмы синаптической передачи [4]. Известно, что дофамин модулирует электрическую и химическую передачу в смешанных синапсах МН, образованных окончаниями волокон VIII нерва, а также реакцию избегания у золотой рыбки через клеточные механизмы цепи МН [5]. Аппликации дофамина в область МН не только стабилизируют размеры нейронов и вызывают их устойчивость к эффектам длительной стимуляции [6], но и при их воздействии совместно с бета-амилоидом снижают степень дегенерации дендритов и существенно сохраняют ультраструктуру аксо-дендритных синапсов [7]. Однако в реальности увеличение содержания дофамина в мозгу достигается стимуляцией дофаминергической передачи с помощью предшественника дофамина, L-3,4-дигидроксифенилаланина (L-дофа), который, в отличие от дофамина, может преодолевать гематоэнцефалический барьер в норме [8]. Механизм действия дофамина и L-дофа одинаков и связан с разрушением фибрилл бета-амилоида [9]. Принимая во внимание тот факт, что увеличение уровня дофамина в мозгу оказывает антиамилоидогенное действие [4], а в геометрии дендритов заложен патоморфологический механизм нейродегенерации [10], целесообразно применять L-дофа в качестве средства, способствующего сохранению структуры дендритов и аксо-дендритных синапсов.

Цель работы — исследовать трехмерное строение маутнеровских нейронов золотой рыбки и ультраструктуру их афферентных синапсов при воздействии L-дофа и токсического фрагмента 25–35 бета-амилоида (далее — бета-амилоид).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 12 мальках золотой рыбки (Carassius auratus (L)) породы оранда: возраст — 3 мес, длина —3,5 см, масса —2 г. Агрегирование бета-амилоида (Sigma, США), его инъекции в объёме 4 мкл в область расположения МН выполняли, как описано ранее [3, 7]. Для медикаментозного повышения уровня дофамина оранду помещали в 200 мл раствора L-дофа (Леводопа, Torrent Pharmaceuticals Ltd., Индия) в концентрации 20 мг/мл, полагая, что препарат через жабры проникнет в кровь и попадёт в мозг. Ранее нами изучены качественные и количественные характеристики морфофункциональных состояний МН рыбок, подвергнутых раздельно действию указанного фрагмента бета-амилоида и соответствующих контролей [3].

В настоящей работе выбрали два варианта сочетания бета-амилоида и L-дофа. Рыбок разделили на три группы: интактную и две подопытные. В подопытной группе 1 орандам апплицировали бета-амилоид, спустя 1 ч их помещали на 5 ч в раствор L-дофа, фрагментирующего лентовидные фибриллы бета-амилоида согласно установленному in vitro механизму действия [9]. Затем рыбок переносили в аквариумную воду, через 1 ч проводили фиксацию. В подопытной группе 2 оранд выдерживали 5 ч в растворе L-дофа, считая, что накопление дофамина в мозгу с помощью L-дофа стабилизирует актиновый цитоскелет, с которым связана устойчивость структуры МН к повреждающим воздействиям [6]. Аппликацию бета-амилоида выполняли через 20 ч, фиксацию — через 5 ч. В качестве анестезии до аппликации бета-амилоида рыбок помещали в ледяную воду до состояния неподвижности.

Для морфологического исследования у мальков извлекали продолговатый мозг, отсекали участок, содержащий МН. Фиксацию и обработку материала проводили по стандартной электронно-микроскопической методике [3], принятой в лаборатории (руководитель — В.И. Архипов, д.б.н.). У C. auratus (L) МН представляют собой две уникальные гигантские клетки ретикулярной формации, сома и дендриты которых занимают значительный объём продолговатого мозга, а миелинизированные аксоны следуют до кончика хвоста рыбки. От тела клетки ЛД направляется преимущественно в латеральном направлении, а ВД — в вентро-ростральном. Такая траектория дендритов не позволяет охарактеризовать их достаточно полно с помощью традиционного метода световой микроскопии. Именно поэтому изготовляли серийные поперечные срезы толщиной 3 мкм на пирамитоме (LKB, Швеция) и по тем из них, которые содержали МН (примерно 90–100 срезов), воссоздавали целостные нейроны в виде их виртуальных интегральных изображений, дополненных размерами отделов нейрона [11]. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Leica EM UC6 (Leica Microsystems, Германия) из отобранных гистологических срезов отделов МН, переклеенных на новые эпоновые блоки. Контрастировали срезы уранилацетатом и цитратом свинца, изучали в электронном микроскопе JEOL JEM-100B (JEOL, Япония) при увеличении 17 000. Эту работу выполняли в ЦКП «Объединённый Пущинский центр электронной микроскопии» (после 1.04.2019 г. — ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»). На оцифрованных негативах с изображениями аксонных окончаний, контактирующих с проксимальными отделами дендритов МН, в программе Image Tools проводили морфометрическое исследование длины следующих контактов: специализированных синаптических химических (активных зон), электрических (щелевых), а также соседствующих с ними десмосомоподобных, в состав которых входит филаментозный актин [3, 7].

Статистический анализ

Статистическую обработку размеров отделов МН проводили в программе SigmaPlot 11.0, 2008 (Systat Software Inc., США). Статистическую значимость различий оценивали с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса (Kruskal–Wallis test) с попарным сравнением по критерию Тьюки (Tukey’s range test). Статистически значимыми считали различия при р <0,05. Результаты представлены в таблице в виде среднего арифметического значения и ошибки среднего. Статистическую обработку показателей длины контактов выполняли в программе Microsoft Excel 2003 в стандартном пакете Microsoft Office. Статистическую значимость различий между группами оценивали по величине t-критерия Стьюдента (Student’s t-test).

Этическая экспертиза

Эксперименты проводились в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к Приказу Минздрава СССР от 12 августа 1977 г. № 755). На проведение исследования получено разрешение комиссии по биологической безопасности и биоэтике Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (протокол № 7 от 05.03.2019 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интегральные изображения структуры МН как интактных, так и подопытных золотых рыбок представлены на рис. 1. Нейроны интактных рыбок характеризуются хорошо развитыми основными дендритами (рис. 1, а) и ничем существенным не отличаются от интактных нейронов, исследованных нами ранее [3]. При визуальном изучении не зафиксировано патологических изменений формы, строения, размеров ЛД, ВД и соматических отделов МН в опытных группах по сравнению с интактной. Так, ВД и ЛД нейронов у опытных оранд сохраняют концевые ветвления (рис. 1, b, c). Однако в группе 2 у МН с вентральной стороны клеточного тела заметно увеличение числа коротких медиальных дендритов (МД). Результаты морфометрии приведены в табл. 1. Сравнение нейронов по величине отделов показывает однотипные и специфические изменения, характерные для нейронов экспериментальных групп. Так, не обнаружено различий между объёмом сомы и ВД опытных и интактных МН, за исключением уменьшения длины ствола ВД в группе 2. Объём и длина ствола ЛД в обеих опытных группах значимо меньше значений интактной группы, что может указывать на то, что деструктивный процесс начинается с уменьшения длины (не толщины) дендритов. Измерения выявили особенности строения МН, обусловленные очерёдностью в применении бета-амилоида и L-дофа. Воздействие L-дофа после бета-амилоида (группа 2) оказалось более эффективным: объём ЛД и его ветвей был существенно больше в группе 1, чем в группе 2. Однако в группе 2 почти в 2 раза возрастал суммарный объём МД по сравнению с группой 1 и в 3 раза — по сравнению с интактной группой. Суммарные объёмы отделов МН, ветвей и МД имели достаточно близкие значения во всех группах: 253,4 (интактная), 248,8 (группа 1), 245,1·10³ мкм ³ (группа 2).

Рис. 1. Виртуальные изображения интегрального строения маутнеровских нейронов золотой рыбки (Carassius auratus (L)): а — в интактной группе; b — в группе 1 (аппликация бета-амилоида и раствор L-дофа); c — в группе 2 (раствор L-дофа и аппликация бета-амилоида). Глутар-осмиевая фиксация, заключение в эпон. Обозначения: С — сома клетки; ЛД — латеральный дендрит; ВД — вентральный дендрит; МД — медиальный дендрит; АК — аксон.

Таблица 1. Морфометрические показатели различных отделов маутнеровских нейронов в интактных и опытных группах золотых рыбок (M±m)

Table 1. Morphometric parameters of different sections of Mauthner neurons in intact and experimental groups of goldfish (M±m)

Группы / Groups	Сома / Soma	Латеральный дендрит / Lateral dendrite			Вентральный дендрит / Ventral dendrite			Медиальные дендриты / medial dendrites
Группы / Groups	объём / volume, 10³ мкм³	объём ствола / stem volume, 10³ мкм³	суммарный объём ветвей / total branches volume, 10³ мкм³	длина ствола / stem length, мкм	объём ствола / stem volume, 10³ мкм³	суммарный объём ветвей / total branches volume, 10³ мкм³	длина ствола / stem length, мкм	суммарный объём / total volume, 10³ мкм³
Интактная /intact (n=8)	127,0±6,7	49,5±4,2	16,0±1,7	139,0±4,3	43,0±4,1	10,2±1,4	202,0±9,4	7,1±1,2
Подопытная / experimental № 1 (n=8)	121,0±3,3	36,0±1,4*	30,0±3,6**	96,0±4,8**	31,0±4,1	16,0±5,6	190,0±10,0	14,5±2,1
Подопытная / experimental № 2 (n=8)	129,0±7,3	28,8±1,6**^{, ##}	14,5±11,5^##	80,9±4,8**	34,4±3,8	14,5±3,1	173,0±3,0*	23,7±3,0**^{, #}

Примечание. Подопытные группы: № 1 — бета-амилоид и L-дофа, № 2 — L-дофа и бета-амилоид; n — число исследованных нейронов. *p <0,05, **p <0,01 — по сравнению с интактными маутнеровскими нейронами, ^#p <0,05, ^##p <0,01 — по сравнению с маутнеровскими нейронами в группе 1.

Note. Experimental groups: No. 1 — beta-amyloid and L-dopa, No. 2 — L-dopa and beta-amyloid; n — number of studied neurons. *p <0,05, **p <0,01 — compared with intact ones, ^#p <0,05, ^##p <0,01 — compared with Mauthner neurons in group 1.

Электронно-микроскопическое изучение соматической части МН в опытных группах не выявило в строении ядра и ядрышка изменений, которые отличали бы группы 1 и 2 друг от друга, а также от интактной группы. Ядра светлые, гетерохроматин в виде небольших глыбок равномерно распределён в гомогенной кариоплазме. Ядрышки — сферической формы, крупные, электронно-плотные, локально видна их фибриллярная структура (рис. 2, а, b). Комплекс Гольджи слабо гипертрофирован. Как и у интактных МН, крупные и среднего размера митохондрии округлые и выглядят слегка набухшими. У части из них кристы отсутствуют или их остатки смещены к наружной мембране органеллы, а центр содержит вакуоль. У небольших митохондрий отмечена локальная инвагинация мембран в полость органеллы (см. рис. 2, a, b). Гладкая эндоплазматическая сеть (эндоплазматический ретикулум) представлена многочисленными вакуолями. В цитоплазме присутствуют фагосомы (рис. 2, c) и остаточные тельца. Изменений в структуре, составе и взаиморасположении элементов цитоскелета МН в опытных группах по сравнению с интактной группой не обнаружено. Миелиноподобные образования встречаются редко и только в постсинаптической цитоплазме. Строение аксодендритных синапсов характеризуется некоторыми особенностями в подопытных группах. Бутоновидные окончания, образующие контакты химического типа с МН группы 1 отличаются от аналогичных структур в интактной группе только тем, что в ряде «бутонов» синаптические везикулы агрегируются в группки или цепочки (см. рис. 2, c). Такого типа окончания в группе 2 выглядят иначе. Некоторые «бутоны» отделяются узкими цитоплазматическими выростами МН, при этом везикулы сосредоточены у активной зоны с неопределяемыми контурами пре- и постсинаптических мембран (рис. 2, d). Встречаются также «бутоны», в которых везикулы изолированы двойным мембранным контуром. Подобные вдавливания одного аксонного окончания в другое могут быть вызваны травмирующим действием жёстких амилоидных фибрилл, обволакивающих нейроны и нарушающих характерное для МН кластерное расположение «бутонов». Однако дегенерирующие по тёмному типу окончания c повышенной осмиофильностью структур не обнаружены. Появляются, но крайне редко, опустошённые синапсы обычного размера, в центре которых либо локализуется крупная вакуоль, либо они заполняются гетерогенными по форме и размерам синаптическими везикулами (не представлено).

Значительная часть булавовидных окончаний, образующих электрический контакт с поверхностью МН из группы 1, содержит набухшие митохондрии с повреждёнными кристами (рис. 2, e). Таких изменений митохондрий в подобных синапсах в группе 2 нет. Однако в постсинаптической зоне обнаружено нехарактерное отгораживание элементов цитоскелета цистернами продольного ретикулума (рис. 2, f). Анализ морфометрических измерений не выявил различий в длинах специализированных синаптических контактов.

Рис. 2. Ультраструктура маутнеровских нейронов золотой рыбки (Carassius auratus (L)) и их афферентных синапсов: а, с, е — в группе 1 (аппликация бета-амилоида и раствор L-дофа); b, d, f — в группе 2 (раствор L-дофа и аппликация бета-амилоида). Глутар-осмиевая фиксация, заключение в эпон. Обозначения: КГ — комплекс Гольджи; Я — ядро; Яд — ядрышко; СВ — синаптические везикулы; АО — аксонное окончание; М — митохондрия; ДК — десмосомоподобный контакт; Ф — фагосома; АЗ — активная зона; ЦВ — цитоплазматический вырост; ЩК — щелевой контакт; ЭПР — эндоплазматический ретикулум.

ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что сома и ВД проявляют устойчивость к нейротоксическому действию бета-амилоида, поскольку объёмы этих отделов МН не изменились. Разная степень уязвимости зафиксирована у ЛД. В группе 1 (L-дофа после бета-амилоида) благодаря разрушающему миелоидные фибриллы эффекту L-дофа [9] ЛД оказались более устойчивыми, чем в группе 2.

Важно отметить, что изменения структуры ЛД в опытных группах сопровождаются разными компенсаторными реакциями. В группе 1, по-видимому, за счёт смещения точки бифуркации к соматической части МН возрастает объём ветвей дендритов, что увеличивает воспринимающую поверхность ЛД. В группе 2 (L-дофа до бета-амилоида) объём ЛД уменьшается существеннее, однако этот эффект нивелируется ростом МД, что тоже увеличивает поверхность МН. О феномене гипертрофии одиночных МД при глубокой дегенерации клеточных тел и основных дендритов МН сообщалось ранее [3]. Считается, что строение дендритов предопределено генетически и поддерживается внутренним гомеостазом, одной из характеристик которого могут быть показатели дендритных измерений: длины дендритов, количества ветвей, площади поверхности [12]. В регуляцию размеров дендритов вовлечены внешние и внутренние факторы для нейрона, такие как химические и электрические сигналы от входящих волокон, баланс медиаторных систем, адаптивные и другие влияния. Анализируя количественные данные, полученные в этой работе в результате морфометрии и статистического анализа в совокупности, и учитывая достаточно близкие значения интегральных объёмов МН в интактной и подопытных группах, можно признать, что с помощью L-дофа целостные МН проявляют морфологическую устойчивость к действию бета-амилоида. Такая стабильность, по нашему мнению, обусловлена влиянием механизма клеточного гомеостаза, направленного на восстановление морфологической организации МН для выполнения их функции.

Исследование ультраструктуры МН в подопытных группах не выявило изменений деструктивного характера в строении ядерного аппарата, элементов цитоскелета большинства органелл и специализированных синаптических контактов. Гипертрофия комплекса Гольджи и гладкого эндоплазматического ретикулума, набухание митохондрий вполне могли быть реакцией нейронов на повреждение. Однако появление миелиновых структур, фагосом, деструкция части пула митохондрий свидетельствуют о начале патологического процесса. Такие изменения не отражаются на объёме соматических отделов, находящихся под контролем актинового цитоскелета, элементы которого ещё не затронуты. На признаки амилоидоза также может указывать ультраструктура афферентных синапсов. Образование инвагинированных аксонных окончаний, агглютинация синаптических везикул, трансформация митохондрий свидетельствуют о дефиците синаптических и митохондриальных процессов. Представленный в работе анализ ультраструктурных последствий показывает, что у МН при воздействии L-дофа после бета-амилоида ультраструктура существенно отличается от таковой у МН после аппликации только бета-амилоида: в последнем случае наблюдаются нарушения контура плазматической мембраны, деструкция цитоскелета, вакуолизация цитоплазмы, изменения формы и содержимого митохондрий, опустошение везикулярного аппарата афферентных синапсов [3].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение L-дофа замедляет дегенерацию дендритов маутнеровских нейронов золотой рыбки. Предполагается, что устойчивость этих нейронов к действию бета-амилоида может регулироваться клеточным гомеостатическим механизмом с участием L-дофа. При этом электронно-микроскопически всё же выявляются ранние признаки амилоидоза, прогрессирование которого, очевидно, может приводить к разрушению этого механизма, что свидетельствует о необходимости продолжения нейроморфологических исследований с использованием L-дофа при моделировании амилоидоза.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: Н.Р. Тирас, Н.А. Пенькова — концепция и дизайн исследования; Н.Р. Тирас, И.Б. Михеева, Г.З. Михайлова, Н.А. Пенькова, С.С. Хуцян — сбор и обработка материала; Г.З. Михайлова, Н.А. Пенькова — статистическая обработка данных; Н.Р. Тирас, Г.З. Михайлова — анализ и интерпретация данных; Н.Р. Тирас — написание текста, редактирование. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

ADDITIONAL INFO

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors contribution: N.R. Tiras and N.A. Penkova created the study concept and design; N.R. Tiras, I.B. Mikheeva, G.Z. Mikhailova, N.A. Penkova, and S.S. Khutsyan collected and processed the material; G.Z. Mikhailova, and N.A. Penkova performed statistical data processing; N.R. Tiras and G.Z. Mikhailova performed data analysis and interpretation; N.R. Tiras wrote and edited the text. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).