Klebsiella–Candida arthritis model in Wistar rats

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Наряду с бактериальным фактором, нередкая причина инфекционного артрита — дрожжеподобные грибы. Самым частым грибковым патогеном считается C. albicans [1]. Известно, что к артритогенным микроорганизмам относятся энтеробактерии рода Klebsiella spp., обладающие антигеном HLA-B27 и потому способные к феномену антигенной мимикрии. В 2018 г. появились данные о высокой аффинности пептидов клеточной стенки грибов рода Candida к HLA-B27-антигену, что ранее было доказано в отношении клебсиелл [2]. В связи с этим представляется целесообразным создание экспериментальной модели инфекционного артрита.

Цель исследования — разработка модели клебсиеллёзно-кандидозного артрита на крысах линии Wistar для определения эффективности антибактериальных и антимикотических препаратов — неотъемлемых компонентов лечения инфекционных артритов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 20 крысах — взрослых самцах линии Wistar массой 350±20 г, из которых 15 животным вводили бактериально-грибковую взвесь. Группа контроля — 5 интактных крыс.

Длительность эксперимента — 15 сут (с ежедневным наблюдением за животными). В первые сутки эксперимента крысам под наркозом (ксилазин внутримышечно в дозе 0,05 мл/кг массы тела и препарат Zoletil-50 в дозе 0,5 мг/кг массы тела) вводили бактериально-грибковую взвесь в дозе 0,125 мл в суставную полость скакательного сустава (заплюсневый сустав из блока костей голени, заплюсны и проксимального конца плюсневых костей) правой задней конечности под контролем рентгеновского аппарата и дигитайзера FireCR+ (3DISC, Франция). Для получения бактериально-грибковой взвеси использовали музейные штаммы K. pneumoniae ICIS-278 и C. albicans из коллекции АТСС 24433. Культуры K. pneumoniae и C. albicans выращивали на плотной питательной среде: агар Шедлера (Schaedler Agar; BBL, США) и Бигги-агар (Bi.G.G.Y. Agar, Nickerson Agar; HiMedia, Индия) при 37 °С в течение 24 ч, с последующим приготовлением взвеси с концентрацией микроорганизмов 10⁶ КОЕ/мл.

Критерии оценки артрита:

• изменения в поведении крыс;
• симптомокомплекс (воспаление и болезненные проявления) в заражённых суставах, определяемый при осмотре;
• нарушение движения в инфицированных суставах;
• патоморфологические изменения в суставах.

После эвтаназии животных под эфирным наркозом исследуемые суставы обработали спиртом, вскрыли суставную полость стерильными скальпелем и ножницами, провели бактериологический посев бактериологической петлёй с суставной поверхности на чашки Петри со следующими средами: агар Эндо (Endo Agar), кровяной и агар Никерсона (Bi.G.G.Y. Agar).

Для гистологического исследования взяты отсепарированные скакательные суставы с максимальным сохранением топографии. Декальцинацию кусочков проводили в 25% растворе Трилона Б с добавлением 40% раствора NaOH в течение 1 мес. В дальнейшем объекты подвергали дегидратизации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в целлоидин-парафин. Срезы толщиной 5–6 мкм, изготовленные на ротационном микротоме МПС-2 («Точмедприбор», Украина), после депарафинирования окрашивали гематоксилином Майера и эозином, а также по Граму — для дифференциации бактерий.

Этическая экспертиза

Информация о результатах проверки протокола исследования: локальный этический комитет Оренбургского государственного медицинского университета (протокол № 151 от 19.10.2016) подтверждает, что данный эксперимент проводился согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к Приказу Минздрава СССР от 12 августа 1977 г. № 755) и был одобрен, а статья соответствует требованиям, предъявляемым к подобным публикациям, и оба не противоречат законодательству Российской Федерации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На 2-е сутки после заражения крысы становились малоподвижными, на поражённую конечность наступали с осторожностью, при пальпации отдергивали её; выявлена местная гипертермия. Средняя окружность скакательного сустава на 3-и сутки после заражения увеличилась с 8,2±0,3 до 23,1±0,4 мм. В контрольной группе поведение животных было обычным, суставного синдрома не отмечалось.

На 15-е сутки, после эвтаназии животных и вскрытия полости поражённых суставов, выполнено бактериологическое исследование суставов: у 75% крыс обнаружены грамотрицательные бактерии K. pneumoniae, идентичность которых исходному штамму, входящему в состав бактериально-грибковой взвеси, подтверждена данными полимеразной цепной реакции. Однако дрожжевые грибы рода Candida, также используемые при заражении крыс, не высевались из поражённых суставов. Этот феномен можно объяснить разнонаправленностью межмикробных взаимоотношений K. pneumoniae и C. albicans, что может проявляться, например, в стимулирующим эффекте грибов в отношении антилизоцимной активности клебсиелл, являющейся одним из факторов выживания (персистенции) бактерий в организме хозяина [3].

Данные гистологического исследования представлены на рис. 1. В полости заплюсневого сустава выявлены отёчная жидкость, выраженный отёк тканевых структур суставной сумки и полнокровие синовиальной оболочки с полиморфно-клеточной инфильтрацией, с преобладанием лимфоцитов и множественными васкулитами (рис. 1, a).

Необходимо отметить, что при клебсиеллёзно-кандидозном артрите наблюдается выраженная дезорганизация соединительнотканных структур суставной сумки. Синовиальная оболочка резко утолщена, отёчна, гиперемирована. Ворсины её подвергнуты гиперплазии, покрыты фибринозным экссудатом, пропитаны нейтрофильными гранулоцитами, лимфоцитами и макрофагами. Дистрофические изменения в стенках сосудов проявляются развитием васкулита, панартериита и периартериита в синовиальной оболочке.

Модель клебсиеллёзно-кандидозного артрита отличается выраженным разрушением суставных хрящей с формированием очагов некроза на суставной поверхности и резорбцией субхондральной костной ткани. При этом отмечаются узуры (эрозии), фиброзные спайки, аномальные очаги хондро- и остеогенеза. Воспроизведённая модель характеризуется также развитием мелкоочаговых гнойно-некротических процессов в гиподерме и дерме околосуставной области, с наличием микроабсцессов и остеомиелита в костных структурах диафиза (рис. 1, b). Описанные выше изменения свидетельствуют о формировании на суставной поверхности грануляционной ткани в виде паннуса, приводящего к фиброзному анкилозу сустава (рис. 1, c).

 

Рис. 1. Гистологические изменения в тканях поражённых суставов крыс с модельным артритом (срез заплюсневого сустава; окраска — гематоксилин Майера и эозин; окуляр — ×10 , объектив — ×20): a — полиморфно-клеточная инфильтрация суставной сумки; b — признаки остеомиелита в костных структурах диафиза; c — формирование паннуса за счет инфильтрации синовиальной оболочки клетками грануляционной ткани. Масштабный отрезок — 20 мкм.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическая оценка патологических изменений суставов крыс при клебсиеллёзно-кандидозном артрите, используемая в данной работе, соответствует известным гистологическим критериям [4, 5]. Особенность данной модели — патоморфологические признаки, характерные для панартрита, с гнойным воспалением всех тканей сустава (синовиальной, хрящевой и костной) и вовлечением мягких околосуставных тканей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная модель клебсиеллёзно-грибкового артрита может использоваться для тестирования новых средств антимикробной терапии — неотъемлемого компонента лечения инфекционных артритов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

ADDITIONAL INFO

Competings interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

About the authors

Elena I. Danilova

Orenburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: danilowa@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-0910-6525
SPIN-code: 5708-1580

MD, Cand. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Orenburg

Andrey P. Fisenko

National Medical Research Center for Children’s Health

Email: info@nczd.ru
ORCID iD: 0000-0001-8586-7946
SPIN-code: 4397-6291

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Moscow

Aleksandr A. Stadnikov

Orenburg State Medical University

Email: k_histology@orgma.ru
ORCID iD: 0000-0002-6107-0534
SPIN-code: 7678-7721

Dr. Sci. (Biol.), Professor

Russian Federation, Orenburg

Natalya B. Perunova

Orenburg Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: icis-ofrc@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-6352-8879
SPIN-code: 9625-1578

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor of the Russian Academy of Sciences, Associate Professor

Russian Federation, Orenburg

Elena V. Ivanova

Orenburg Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: walerewna13@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4974-8947
SPIN-code: 9731-7094

MD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Orenburg

Irina N. Chaynikova

Orenburg Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: chainicova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8923-8829
SPIN-code: 8998-5241

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Orenburg

Olga E. Chelpachenko

Orenburg Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: oech57@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6719-5805
SPIN-code: 2599-5377
Russian Federation, Orenburg

References

Supplementary files