Klebsiella-candida arthritis model in Wistar rats



Cite item

Abstract

Objective - development of   Klebsiella - Candida arthritis model in Wistar rats.

Material and methods. The study was carried out on 20 male Wistar rats, of which 15 animals were injected with a bacterial-fungal suspension by introducing into the cavity of the hock (tarsus) joint Klebsiella-Candida suspension (1: 1) with a microorganism concentration of 106  CFU / ml , using museum strains Klebsiella pneumoniae ICIS - 278 and Candida albicans ATCC 24433 under the control of an X-ray apparatus FireCR +. Five intact animals served as control. On the 15th day of the experiment, after euthanasia, a bacteriological and histological examination of the affected joints was carried out while maintaining their topography.

Results. In rats infected with Klebiella-candidiasis suspension, pain syndrome and functional changes typical for arthritis were noted on days 2-3. Bacteriological examination of the affected joints in 75% of rats isolated cultures of  Klebsiella pneumoniae, identical, according to PCR, to the original strain, which is part of the bacterial-fungal suspension. At the same time, fungi of the genus Candida, also used in the experiment for infecting animals, were not detected from the affected joints of rats. The reproduced model of  Klebsiella-Candida arthritis is characterized by pathomorphological signs of panarthritis, accompanied by purulent inflammation of all joint structures (synovial membrane, cartilage and bone tissue) with the involvement of soft periarticular tissues.

Conclusions. The presented model of Klebsiella-fungal arthritis can be used to test new means of antimicrobial (antibacterial and antifungal) therapy, which are an integral component of the treatment of arthritis associated with infection.

Full Text

Введение. Наряду с бактериальным фактором, нередкой причиной инфекционного артрита (ИА) являются дрожжеподобные грибы. Самым частым грибковым патогеном считается Candida albicans [4]. Известно, что к артритогенным микроорагнизмам относятся энтеробактерии рода Klebsiella spp., обладающие HLA-B27 антигеном и способные в этой связи к феномену антигенной мимикрии. В 2018 году появились данные о высокой аффинности  пептидов клеточной стенки грибов рода Candida к HLA B 27 антигену, что было  ранее доказано в отношении клебсиелл [5].

В этой связи представлялось целесообразным создание экспериментальной модели ИА клебсиеллезно-кандидозной этиологии для определения эффективности  антибактериальных и антимикотических препаратов, являющихся неотъемлемыми компонентами лечения инфекционных артритов.

Целью настоящего исследования явилась разработка модели клебсиелллезно - кандидозного артрита на крысах линии Wistar.

Материал и методы. Работа выполнена на 20 крысах – взрослых самцах линии Wistar массой 350±20 г, из которых 15 животным вводили бактериально-грибковую взвесь, 5  интактных крыс служили контролем. Эксперимент проводился согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Хельсинкская декларация, 1975г , 2000г.) и был одобрен локальным этическим комитетом Оренбургского государственного медицинского университета (№ 151 от 19.10.2016). Длительность эксперимента 15 дней, с ежедневным наблюдением за животными.

В 1-й день эксперимента под наркозом (путем внутримышечного введения ксилазина в дозе 0,05 мл/кг массы тела и препарата «Zoletil 50» в дозе 0,5мг/кг массы тела крысы) крысам вводили бактериально-грибковую взвесь в дозе 0,125 мл в суставную полость скакательного сустава (заплюсневый сустав, образованный блоком костей голени, заплюсны и проксимальным концом плюсневых костей) правой задней конечности под контролем рентгеновского аппарата FireCR+. Для получения бактериально-грибковой взвеси использовали музейные штаммы Klebsiella pneumoniae ICIS–278 и Candida albicans из коллекции АТСС 24433. Культуры K. pneumoniae и C. albicans выращивали на плотной питательной среде Schaedler-агар (BBL, США) и Biggi–агар (Nickerson Agar, HIMEDIA, Индия) при 370 С в течение 24 часов, с последующим приготовлением взвеси с концентрацией микроорганизмов 106 КОЕ/мл.

Критериями оценки артрита служили: изменения поведения крыс; воспалительные явления и болезненные проявления в зараженных суставах, определяемые при осмотре; нарушения движения в инфицированных суставах; патоморфологические изменения в суставах. После эвтаназии животных под эфирным наркозом исследуемые суставы обрабатывали спиртом, вскрывали суставную полость стерильными скальпелем и ножницами, проводили бактериологический посев с суставной поверхности петлей на чашки Петри со средами: Эндо, кровяной агар и Бигги – агар.

Для гистологического исследования были взяты отсепарированные скакательные суставы с максимальным сохранением топографии. Декальцинацию кусочков проводили в 25 % растворе Трилон Б с добавлением 5 мл 40% раствора NaOH в течение 1 месяца. В дальнейшем объекты подвергали дегидратизации в спиртах возрастающей крепости и заливали в парафин-целлоидин. Срезы толщиной 5-6 мкм, изготовленные на ротационном микротоме МПС-2, после депарафинирования окрашивали гемотоксилином Майера и эозином, а также по Граму для дифференциации бактерий.

Результаты исследования. На второй день после заражения крысы становились малоподвижными, на пораженную конечность наступали с осторожностью, при пальпации отдергивали пораженную лапу, выявлялась местная гипертермия. Средняя окружность  скакательного сустава на 3-й день после заражения увеличилась с 8,2±0,3мм до 23,1±0,4 мм. В контрольной группе поведение животных было обычным, суставного синдрома не отмечалось.

На 15-й день, после эвтаназии животных и вскрытия полости пораженных суставов  выполнено бактериологическое исследование суставов, при котором у 75% крыс обнаружены грамотрицательные бактерии Klebsiella pneumoniae, идентичность которых исходному штамму, входящему в состав бактериально-грибковой взвеси,  подтверждена данными ПЦР-анализа. Необходимо отметить, что грибы рода Candida, так же используемые в эксперименте при заражении животных, не высевались из пораженных суставов крыс. Этот феномен можно объяснить разнонаправленностью межмикробных взаимоотношений Klebsiella pneumonia и Candida albicans. При совместном культивировании данных микроорганизмов подавляется формирование ростовых трубок у дрож­жевых клеток, что указывает на антагонизм клебсиелл по отношению к грибам Candida и позволяет исключить влияние скорости роста микроорганизмов на их количественный уровень в ассоциациях. В тоже время, дрожжевые грибы обладают стимулирующим эффектом в отношении ростовых характеристик и антилизоцимной активности клебсиелл [1].

Данные гистологического исследования представлены на рисунке 1.  В полости заплюсневого сустава выявлены отечная жидкость, выраженный отек тканевых структур суставной сумки и полнокровие синовиальной оболочки с полиморфно-клеточной инфильтрацией, преобладанием лимфоцитов и множественными васкулитами (рис. 1а). Необходимо отметить, что при клебсиеллезно-кандидозном артрите наблюдается  выраженная дезорганизация соединительнотканных структур суставной сумки. Синовиальная оболочка резко утолщена, отечна, гиперемирована. Ворсины ее подвергнуты гиперплазии, покрыты фибриноидным экссудатом, пропитаны нейтрофильными гранулоцитами, лимфоцитами и макрофагами. Дистрофические изменения в стенке сосудов проявляются развитием васкулита, панартериита и периартериита в синовиальной оболочке. Модель клебсиеллезно-кандидозного артрита отличается выраженным разрушением суставных хрящей с формированием очагов некроза в области суставной поверхности и разрушением субхондральной костной ткани. При этом отмечаются «узуры», фиброзные спайки, аномальные очаги хондро- и остеогенеза. Воспроизведенная модель характеризуется также развитием мелкоочаговых гнойно-некротических процессов в гиподерме и дерме околосуставной области, с наличием микроабсцессов и остеомиелита в костных структурах диафиза (рис. 1б). Описанные выше изменения свидетельствуют об образовании на суставной поверхности грануляционной ткани в виде паннуса, приводящего к фиброзному анкилозу сустава (рис. 1в).

Обсуждение полученных данных. Используемая нами морфологическая оценка патологических изменений суставов крыс при клебсиеллезно-кандидозном артрите соответствует известным гистологическим критериям [2, 3] Особенностью данной модели является то, что она сопровождается  патоморфологическими признаками, характерными для панартрита, с гнойным воспалением всех структур сустава (синовиальной оболочки, хрящевой и костной ткани) с вовлечением мягких околосуставных тканей.

Заключение. Таким образом, представленная модель клебсиеллезно-грибкового артрита может использоваться для тестирования новых средств антимикробной терапии, являющихся неотъемлемым компонентом лечения артритов, связанных с инфекцией.

 

Вклад авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.П.Ф., А.А.С.

Сбор и обработка материала: Е.И.Д., Н.Б.П.

Анализ и интерпретация данных: Е.В.И., И.Н.Ч.

Написание текста: О.Е.Ч.

 

×

About the authors

Elena I. Danilova

Оренбургский государственный медицинский университет

Author for correspondence.
Email: danilowa@list.ru

кафедра педиатрии Института последипломного образования

Russian Federation

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Eco-Vector

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 0110212 от 08.02.1993.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies