DYNAMICS OF THE EXPRESSION OF IONOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR GLUR2 SUBUNIT IN THE VENTROLATERAL PART OF A SOLITARY TRACT NUCLEUS IN THE EARLY POSTNATAL PERIOD IN NORM AND IN PRENATAL SEROTONIN DEFICIENCY

全文:

Одной из основных функцией ядра одиночного пути (ЯОП) является интеграция информации, поступающей от внутренних органов [3], где респираторные, кардиоваскулярные и другие афферентные импульсы опосредуются глутаматом [5]. Вентральное и латеральное субъядра представляют собой группу дорсальных респираторных ядер и входят в состав бульбарного дыхательного центра. Значительная часть нейронов этих ядер являются инспираторными [3], регуляция взаимодействий между которыми осуществляется, главным образом, через высвобождение глутамата и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Передача возбуждения, как правило, осуществляется действием глутамата на два основных ионотропных рецептора - NMDA (связывающего N-метил-D-аспартат) и AMPA (2-альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазольпропионовую кислоту). AMPA является тетрамером, состоящим из субъединиц, сочетание которых определяет структуру, ионную селективность, проводимость и кинетику активации рецептора [22]. Установлено, что проницаемость для кальция АМРА-зависимых ионных каналов определяется наличием в составе рецептора субъединицы (GluR2), причем, как полагают, приток кальция через синапсы в период активного синаптогенеза является необходимым для формирования и специализации структурных и функциональных свойств нейральных сетей [9, 12]. Однако данных о динамике экспрессии GluR2 в респираторных субъядрах ЯОП в ранний постнатальный период (т. е. период созревания респираторной системы у млекопитающих и человека) практически нет. В ЯОП серотонин (5-hydroxytryptamine; 5-HT), наряду с другими трансмиттерами, также вовлекается в нейротрансмиссию глутамата из висцеральных афферентных окончаний [17]. В субъядрах ЯОП содержится значительное количество серотониновых волокон, которые, как показано, приходят из медуллярных ядер шва [20]. Установлено, что в ЯОП имеется постоянное спонтанное высвобождение серотонина из терминалей серотонинергических волокон, причем выделение медиатора является регулируемым при помощи системы его обратного захвата [7]. В ЯОП обнаружена самая интенсивная в мозгу экспрессия ионотропных рецепторов 5-HT. Эти пресинаптические рецепторы, активируемые 5-HT, вызывают высвобождение глутамата из афферентных терминалей, который, в свою очередь, приводит к возбуждению постсинаптических нейронов в ЯОП [11, 14, 16]. Однако неизвестно, будет ли влиять пренатальное изменение содержания серотонина на экспрессию ионотропных глутаматных GluR2-содержащих рецепторов и, как следствие, на возбудимость нейральной сети. В связи с этим, цель настоящей работы - изучить динамику экспрессии GluR2 в респираторных субъядрах (вентральном и латеральном) ЯОП в ранний постнатальный период в норме и при пренатальном снижении содержания серотонина. Материал и методы. Работа проведена на лабораторных крысах Вистар (n=18). Содержание животных и все экспериментальные процедуры проведены в соответствии с «Правилами содержания и проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для снижения эндогенного содержания серотонина использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы (фермента его синтеза) парахлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США), который вводили внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг самкам на 9-е сутки беременности (для длительного снижения эндогенного содержания серотонина до 50-80% в период формирования у плодов ЯОП одиночного пути и собственной серотонинергической системы). Головной мозг у родившихся крысят исследовали на 5-, 10-еи 20-е сутки. В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, родившихся у интактных самок (по 5-6 крысят каждого срока как подопытных, так и контрольных). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатносолевом буфере (рH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 5 мкм на уровне Bregma 11.88 - 12.00 [15]. Иммуноцитохимическую реакцию выявления ионотропного рецептора глутамата проводили с использованием мышиных моноклональных антител к GluR2 (Abcam, США). В качестве вторичных реагентов для выявления GluR2 использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). Клеточная локализация GluR2: плазмолемма, в цитоплазме - мембраны эндоплазматической сети, клеточные контакты - синапсы, постсинаптическая мембрана. Условия проведения иммуноцитохимической реакции были стандартизированы, все процедуры с гистологическими срезами продолговатого мозга, полученными от контрольных и подопытных животных, осуществляли одновременно. После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали тионином (Serva, США, Германия) и заключали в синтетическую среду Permount (Thermo Fisher Scientific, США). Морфологический анализ и количественное исследование проводили на цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия). Подсчитывали число иммунопозитивных нейронов на стандартной площади, равной 0,1 мм², и учитывали плотность сплетения терминальных отростков в нейропиле, определяли плотность распределения зерен и крупных гранул (последние, предположительно, считаются терминальными синаптическими структурами и их скоплениями) [10]. Для проведения оценки оптической плотности продукта реакции в цитоплазме нейронов и нейропиле использовали изображения, полученные с помощью цифровой видеокамеры, и програмное обеспечение ВидеоТест Мастер Морфология (ООО «Видео Тест», Санкт-Петербург). Вычисляли среднее арифметическое значение и его ошибку, критическим уровнем значимости считали P<0,05, статистическую обработку проводили средствами анализа ANOVA (Statistica 7.0, Statsoft Inc., США). Результаты исследования. Латеральное субъядро ЯОП. На 5-е сутки у контрольных животных на единице площади выявляются 16,3±1,1 нейронов со слабо окрашенной цитоплазмой (оптическая плотность равна 0,0751) (рисунок, а). На 9-е сутки число иммунопозитивных нейронов сохраняется - 15,7±1,4, но интенсивность реакции слегка увеличивается (0,0857) (см. рисунок, в). На 20-е сутки численность иммунопозитивных нейронов возрастает в 2 раза и составляет 31,6±0,9, а интенсивность реакции (0,0872) практически не меняется (см. рисунок, д). В нейропиле во все исследованные сроки слабо иммунопозитивные отростки образуют рыхлую сеть. На 5-е сутки у экспериментальных животных в латеральном субъядре на единице площади выявляется 3,1±0,3 нейрона со слабо иммунопозитивной цитоплазмой (0,0491) (см. рисунок, б). В нейропиле практически нет иммунопозитивных отростков. На 9-е сутки выявляется 12,4±1,2 иммунопозитивных нейрона, интенсивность окраски цитоплазмы и сети отростков в нейропиле практически не изменяется (0,0489) (см. рисунок, г). На 20-е сутки число иммунопозитивных нейронов - 16,2±1,5, что в 2 раза меньше, чем в контроле, интенсивность иммунной реакции цитоплазмы и отростков слабая (0,0504) (см. рисунок, е). Вентральное субъядро ЯОП. На 5-е сутки у контрольных животных в вентральном субъядре на единице площади выявляется 15,5±1,6 нейрона, имеющих слабую иммунопозитивную реакцию цитоплазмы (0,0714). На 9-е сутки число иммунопозитивных нейронов - 18,5±1,3 и интенсивность реакции цитоплазмы (0,0796) примерно соответствуют таковым на 5-е сутки. На 20-е сутки численность иммунопозитивных нейронов резко возрастает до 47,6±1,8 (в 2,6 раза), при этом интенсивность окрашивания увеличивается незначительно (0,0841). В нейропиле во все исследованные сроки слабо окрашенные отростки образуют рыхлую сеть. На 5-е сутки у подопытных животных в вентральном субъядре иммунопозитивные нейроны не выявляются. В нейропиле окрашены отдельные отростки. На 9-е сутки число иммунопозитивных нейронов составляет 19,7±1,2, при этом интенсивность окрашивания цитоплазмы нейронов слабая (0,0412). На 20-е сутки выявляется 17,6±1,8 иммунопозитивных нейрона, что в 2,4 раза меньше, чем в контроле, интенсивность иммунной реакции не изменяется (0,0498). Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что в ЯОП в ранние постнатальные сроки в обоих респираторных субъядрах имеется примерно одинаковый уровень экспрессии GluR2-содержащих рецепторов, об этом свидетельствует как число нейронов, экспрессирующих GluR2, так и интенсивность иммуноцитохимической реакции. К ювенильному возрасту происходит значительное повышение экспрессии GluR2, в латеральном - в 2 раза, в вентральном субъядре - в 2,6 раза, при этом интенсивность реакции повышается незначительно (в 1,1 раза). Установлено, что в эмбриогенезе у крыс нейроны ЯОП появляются рано между 10-ми и 14-и сутками развития, а афферентные волокна одиночного пути начинают появляться в ЯОП на 15-е сутки [2, 18], при этом слабая возбуждающая синаптическая активность здесь была зарегистрирована на 18-е сутки [23]. Исследования показали, что реакция на GluR2 выявлялась также на 18-е сутки, и места окрашивания практиче ски совпадали с точками при реакции на синаптофизин. Более того, локализация синаптических структур при выявлении GluR2, была подтверждена одновременным обнаружением глутаматергических терминалей [13]. Наблюдения показали, что между 18-и сутками внутриутробного развития и началом постнатального периода плотность GluR2-иммунопозитивных структур возрастала приблизительно в 3 раза, а в первую неделю после рождения и до 21-х суток она увеличивалась еще в 2 раза [4]. Полученные результаты подтверждают эти данные и свидетельствуют о том, что к ювенильному возрасту в респираторных субъядрах ЯОП происходит значительное увеличение экспрессии GluR2 (в 2-2,6 раза) по сравнению с таковой в ранний неонатальный срок. Установлено, что АМРА-рецептор является тетрамером, состоящим из различных комбинаций четырех основных субъединиц, называемых GluR1, GluR2, GluR3 и GluR4. АМРА-рецептор, не содержащий GluR2, является высокопроницаемым для ионов кальция [12], при этом присутствие одной GluR2субъединицы в составе гетеромерного АМРАрецептора обеспечивает его непроницаемость для ионов кальция [21]. Наблюдения показали, что в ходе раннего развития и формирования синаптических сетей сначала имеет место экспрессия АМРА-рецепторов, не содержащих GluR2-субъединицу, которая, впоследствии постепенно включается в его состав. Отмечено, что во время нейрального развития этот процесс является общим для других областей мозга [8, 12, 19]. Полагают, что в ранние сроки (во время раннего синаптогенеза) внутриклеточный приток кальция через AMPA-зависимые ионные каналы является важным в формировании и созревании синаптических структур, а также подчеркивают роль кальция в процессах, стимулирующих трансформацию самих синапсов [6, 12, 19], которые в результате определяют формирование структурных и функциональных свойств нейральных сетей. Более того, присутствие GluR2 в составе АМРА-рецептора влияет не только на проницаемость АМРА-зависимых каналов для ионов кальция, но и создает молекулярную основу для развития синаптической пластичности [12]. Установлено, что в ЯОП возбуждающие глутаматные ионотропные GluR2-содержащие рецепторы появляются в конце пренатального периода [13]. Результаты данного исследования показали, что в респираторных субъядрах ЯОП на ранних этапах перинатального периода экспрессия GluR2 начинает повышаться, а в постнатальный период к ювенильному возрасту значительно увеличивается. Вероятно, первые 3 нед постнатального развития в респираторных субъядрах ЯОП являются критическим периодом в формировании и созревании глутаматергической синаптической сети. Установлено, что в ЯОП серотонин играет роль в трансмиссии глутамата. Его возбуждающее действие проявляется через активацию своих ионотропных рецепторов (5-HT3), локализующихся в основном пресинаптически на афферентных терминалях волокон одиночного пути [14, 16], что приводит к высвобождению глутамата, который, в свою очередь, вызывает активацию ионотропных постсинаптических АМРА-рецепторов и возбуждение нейронов ЯОП [11]. Результаты исследования показали, что в респираторных субъядрах ЯОП в ранний постнатальный период пренатальный дефицит серотонина изменяет экспрессию GluR2. В ранние сроки имеет место либо задержка экспрессии GluR2, либо незначительная его экспрессия. На 9-е сутки экспрессия GluR2 повышается и примерно соответствует таковой в контроле, однако, к ювенильному возрасту она не изменяется и оказывается в 2 раза ниже контрольных значений. Такое снижение экспрессии GluR2, вероятно, может быть вызвано нарушением процессов синтеза рецепторных белков и сокращением их количества, что в результате будет приводить к нарушению формирования синапсов и возбуждающей глутаматергической рецепторной сети в постнатальный период, также одной из причин может быть уменьшение числа постсинаптических мишеней для афферентных волокон одиночного пути, являющееся результатом структурных нарушений развития самого ЯОП. С другой стороны, вероятно, пренатальное снижение содержания серотонина может приводить к уменьшению количества серотониновых волокон, приходящих от медуллярных ядер шва, и, как следствие, вызывать вторичное снижение уровня высвобождаемого в ЯОП серотонина, а также к нарушению развития иннервации респираторных органов и уменьшению числа афферентных волокон, приходящих от них в ЯОП и, как результат, резкому снижению содержания рецепторов серотонина, локализующихся на их терминалях и участвующих в высвобождении глутамата. Проведенное исследование показало, что в респираторных субъядрах ЯОП первые 3 нед постнатального периода развития являются критическими для формирования возбуждающей рецепторной сети. Выявленное снижение экспрессии возбуждающих глутаматных ионотропых GluR2-содержащих рецепторов, вызванное пренатальным дефицитом серотонина [1], будет несомненно нарушать нормальный баланс возбуждения и торможения в респираторных субъядрах уже в ранние сроки развития и приводить к респираторным дисфункциям.

作者简介

L. Khozhai

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru
Laboratory of the Nervous System Ontogenesis

参考

补充文件