GENDER-RELATED PECULIARITIES OF THE MYOCARDIAL REGENERATIVE CAPACITIES IN EXPERIMENTAL CARDIAC FAILURE

全文:

В результате экспериментальных и клинических исследований получены доказательства половых особенностей ремоделирования сердца [6]. Показано, что при одинаковых патологических условиях изменения в миокарде на молекулярном и клеточном уровне оказываются менее значительными у женщин, чем у мужчин [9]. Половой диморфизм и лучший исход сердечнососудистых заболеваний у женщин в большинстве случаев связывают с кардиопротективными воздействиями эстрогенов на миокард [6]. Считается, что половые особенности ремоделирования миокарда можно объяснить не только активностью половых гормонов. При сканировании генома были выявлены половые различия в некоторых генах и/ или молекулярных путях, регулирующих структуру кардиомиоцитов (КМЦ) с последующим влиянием на их сократительную функцию [9]. В настоящее время экспериментальные исследования половых различий продолжаются, но существуют ли они в эндогенном регенераторном потенциале миокарда и влияют ли на особенности его ремоделирования при сердечной недостаточности (СН), остаются до конца неясными. Цель настоящей работы - изучить особенности регенераторного потенциала миокарда левого желудочка (ЛЖ) у крыс обоего пола в условиях экспериментальной сердечной недостаточности (СН). Материал и методы. Исследование проведено на 40 крысах: самцах (n=15) и самках (n=25) линии Вистар массой 230-260 г. Контролем служили 10 интактных крыс: самцов (n=5) и самок (n=5). С целью моделирования гипоэстрогенного состояния у 10 крыс под анестезией эфирным рауш-наркозом проводили билатеральную овариэктомию (ОЭ). Через 2 мес после билатеральной ОЭ у ОЭ-самок (n=40), у интактных самок (n=10) и у самцов (n=10) вызывали СН путем подкожного введения в течение 14 сут 0,1 мл 1% раствора мезатона с последующим плаванием до глубокого утомления [3], после чего животных декапитировали под эфирным рауш-наркозом. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказами МЗ СССР № 1045 от 06.04.1973 г., № 1179 от 10.10.1983 г. Миокард ЛЖ у контрольных и экспериментальных крыс был подвергнут стандартной однотипной гистологической обработке. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера - эозином. Проводили иммуногистохимические (ИГХ) реакции: оценку экспрессии синтеза белков Ki-67 - индекс пролиферации (ИП), виментина (vim) - степень фиброза и каспазы-9 (cas-9) - индекс апоптоза (ИА) с использованием моноклональных антител и набора реактивов (Spring Bioscience, США). ИП и ИА определяли как число окрашенных КМЦ, деленное на 1000 клеток в случайно выбранных 20 полях зрения. Оценку локализации и интенсивности иммунной реакции vim+ проводили полуколичественным методом +/++++ в случайно выбранных 20 полях зрения (100%): (-) - нет иммунопозитивных клеток в миокарде; (+) - легкая, изменения единичных клеток; (++) - умеренная, изменения мелкоочагового характера или группы клеток; (+++) - высокая, крупноочаговые изменения или изменения в большой группе клеток, (++++) - тотальные изменения, все клетки иммунопозитивны. Морфометрию осуществляли в соответствии со сложившимися принципами системного количественного анализа [1]. Цитологический анализ структурно-функциональной реорганизации мышечной и стромальной частей миокарда проводили в условных полях зрения микроскопа OPTIKA B-350 (Италия), микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры ScopeTek DCM 500 (Италия) и программы ScopePhoto с указанной окулярной вставкой при исследовании 20 полей зрения гистологических срезов (об. 40, ок. 20). Для определения объемной плотности (ОП) КМЦ, их ядер и стромы миокарда было применено наложение квадратной сетки (Pt=225) на микрофотографии гистологических срезов миокарда при стандартном увеличении. Методом сплошного подсчета оценивали относительное содержание КМЦ с 1, 2, 3 ядрами и более. В каждом препарате исследовали не менее 1000 клеток. Статистический анализ количественных данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 6.0 и Excel. Определяли среднее значение и его стандартную ошибку. Различия считали значимыми при P≤0,05. Результаты исследования. Миокард у интактных животных на светооптическом уровне имел строение, свойственное всем млекопитающим. При этом в сердечной мышце у здоровых крыс-самок по сравнению с самцами отмечено некоторое уменьшение диаметра КМЦ и их ядер, уменьшение диаметра и плотности расположения сосудов микроциркуляторного русла (МЦР), а также преобладание пула одноядерных КМЦ (табл. 1). В тканевой реорганизация миокарда у животных всех групп с СН имелись нарушения кровообращения; наблюдались полиморфизм ядер КМЦ и «опустошение» околоядерных зон; гипертрофированные и атрофированные КМЦ. Происходило возрастание объема соединительной ткани более чем в 2 раза в группах ОЭ-самок и самцов с СН по сравнению с контролем (см. табл. 1), увеличение количества полиморфно-клеточных инфильтратов в строме с единично встречающимися внутриклеточно локализованными лимфоцитами в КМЦ. В миокарде ЛЖ самок с СН по сравнению с самцами и ОЭ-самками с СН на фоне умеренной реорганизации мышечных и немышечных элементов миокарда чаще встречались КМЦ с сохраненными морфологическими признаками. Количественные изменения популяции КМЦ характеризовались значимым уменьшением доли одноядерных и увеличением двуядерных КМЦ у самцов с СН по сравнению с противоположными значениями у самок с СН (см. табл. 1). При ИГХ-исследовании миокарда ЛЖ у крыс всех групп регистрировались КМЦ и клетки внеклеточного матрикса (ВМ) с различной степенью экспрессии Ki-67, сas-9, vim (рисунок, а) (по критериям оценки экспрессии Ki-67, каспазы-9, виментина) (табл. 2). В миокарде ЛЖ у интактных крыс обоего пола встречались единичные Ki-67(+) (см. рисунок, б), сas-9(+)-иммунопозитивные КМЦ. Отмечалось увеличение Ki-67(+)-КМЦ в группах крыс-самок с СН и ОЭ-самок с СН по сравнению с контролем и у самцов с СН. Значимое увеличение количества сas-9(+)-КМЦ наблюдалось в миокарде у крыс-самцов с СН и ОЭ-крыс с СН по сравнению с контролем (см. табл. 2). При ИГХ-оценке экспрессии vim в миокарде ЛЖ у интактных крыс обоего пола преобладала легкая и умеренная степень активности vim(+)-клеток ВМ (см. табл. 2). Высокая степень экспрессии vim(+) встречалась в строме миокарда у самцов с СН и меньшая у ОЭ самок с СН по сравнению с контролем и у самок с СН. Обсуждение полученных данных. При экспериментальной СН происходили значительные изменения мышечных и стромальных элементов миокарда, что согласуется с результатами наших предыдущих работ [2, 3]. При этом в миокарде у крыс обоего пола происходила реорганизация как КМЦ, так и ВМ миокарда. Активация стромального компонента миокарда характеризовалась расширением сосудов микроциркуляторного русла с явлениями сладжирования, межмышечным отеком и диапедезом эритроцитов, скоплением клеток фибробласто-подобного ряда. Эти результаты согласуются с ИГХ-картиной экспрессии белка промежуточных филаментов - виментина. При экспериментальной СН возрастание количества vim(+)-клеток между волокнами миокарда и периваскулярно сопровождалось увеличением количества Ki-67(+)-клеток стромы, что демонстрирует пролиферативную активность ВМ. Это согласуется со сведениями о том, что стромальные клетки пролиферируют со значительно большей скоростью (в 20-40 раз), чем КМЦ, обусловливая замещение дефекта в зоне повреждения [5]. При сравнительном анализе выраженность описанных изменений преобладала в строме миокарда у самцов, способствуя развитию диффузного и очагового кардиосклероза. Половые особенности ремоделирования ВМ ряд авторов объясняют более низкой активностью матриксных металлопротеиназ и р-38 МАП-киназ в миокарде у особей женского пола, а также ингибирующим действием эстрогенов на экспрессию генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и пролиферацию фибробластов [9]. При экспериментальной СН наблюдалось возрастание доли гипертрофированных КМЦ с увеличенными в диаметре ядрами, смещенными на периферию. В других, расположенных группами КМЦ со светлой разряженной цитоплазмой встречались небольшие пикнотизированные ядра. Полиморфизм ядер КМЦ, усиление литических повреждений отдельных КМЦ, а также групп мышечных волокон свидетельствуют об истощении компенсаторных механизмов в миокарде, дезадаптации и формировании регенераторно-пластической недостаточности, что согласуется с результатами и других исследователей [4]. Выраженность реактивных процессов в миокарде и значимое снижение объемной плотности КМЦ преобладали у самцов с экспериментальной СН в сравнении с самками обеих групп. По данным ряда работ, одним из возможных механизмов кардиопротекции у особей женского пола считается низкая плотность β-адренорецепторов в КМЦ [6]. Клеточная пролиферация и апоптоз являются сопряженными процессами и важными механизмами поддержания тканевого гомеостаза миокарда. В нашем исследовании отмечалось повышение индекса пролиферации КМЦ (экспрессия белка Ki-67) у крыс обоего пола с экспериментальной СН, со значимым увеличением у крыс-самок с СН в отличие от самцов с СН. КМЦ, экспрессирующие Ki-67(+) в основном были представлены одноядерными, реже двуядерными гипертрофированными или обычных размеров КМЦ. Известно, что покоящиеся клетки (Gₒ) негативны по содержанию Ki-67, антиген экспрессируется в клетках поздней G1 (G1b), а также в клетках S, G2 и М фазах клеточного цикла [11]. Изменение пролиферативной активности КМЦ в нашем исследовании сочеталось с изменением количества одно-, дву- и многоядерных миоцитов. Увеличение Ki-67(+)-КМЦ у самок с СН сопровождалось возрастанием доли одноядерных КМЦ, а у самцов - уменьшением доли одноядерных и увеличением доли двуядерных КМЦ. Данный факт можно рассматривать как половые особенности активации клеточных форм регенерации КМЦ. Можно предположить, что регенеративные процессы могут происходить в миокарде и за счет резидентных клеток, вступающих в митотический цикл уже во взрослом организме, или слияния клеток-предшественников из костного мозга с существующими КМЦ [10]. Рядом исследователей отмечены половые особенности в количестве прогениторных клеток, располагающихся в области предсердий и верхушки сердца, со значимым преобладанием их у особей женского пола, что однозначно может влиять на регенераторные возможности миокарда в норме и при патологии [11]. Считается, что сигнальные пути, приводящие клетку к митозу (протеинкиназа С, клеточные протоонкогены и др.), также обеспечивают чувствительность ее хроматина к эндонуклеазам, запуская при этом программированную клеточную гибель [10]. При анализе апоптотического индекса (экспрессия каспазы-9) выявлены половые особенности, заключающиеся в значимом увеличении КМЦ с признаками апоптоза в группе самцов с СН и несущественном - в группе самок с СН. Половые различия в жизнеспособности КМЦ ряд авторов связывают как с эстроген-индуцированной активацией протеинкиназы В [6], так и с высокой экспрессией теломеразы в КМЦ у особей женского пола [8, 9]. Кроме того, в ряде работ показано, что эстрогены предупреждают снижение мышечной массы миокарда у особей женского пола через активацию аутофагии [7], уменьшая количество атрофически и дистрофически измененных КМЦ, что отмечено и в нашем исследовании. Увеличение индекса апоптоза в группе ОЭ-крыс с СН в сравнении с таковым у самок с СН подтверждает антиапоптотическое действие эстрогенов на миокард. Резюмируя изложенное, можно заключить, что регенераторный потенциал КМЦ и адаптационные возможности миокарда при СН значительно выше у крыс-самок, чем у самцов. Данные различия, на наш взгляд, зависят не только от активности половых гормонов, но, вероятно, имеют многофакторный характер. Механизмы контроля пролиферации КМЦ, включая генетические, связанные с X- и Y-хромосомой, а также с молекулами самых разных классов остаются предметом многочисленных дискуссий. На наш взгляд, более глубокое понимание половых различий пролиферации клеток миокарда, приводящих к особенностям ремоделирования сердца при СН, откроет путь к созданию новых, дифференцированных подходов в лечении пациентов с данной патологией.

作者简介

Yu. Liskova

Orenburg State Medical University

Email: liskovaj@bk.ru
Department of Histology, Cytology, and Embryology

A. Stadnikov

Orenburg State Medical University

Email: alexander.stadnikov@yandex.ru
Department of Histology, Cytology, and Embryology

S. Salikova

S. M. Kirov Military Medical Academy

Email: cardiosvet@rambler.ru
2nd Department of Therapeutics (Advanced Medical Education)

参考

补充文件